促紅素衍生肽ARA290對大鼠移植腎早期損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、隨著器官移植領域技術的飛速發(fā)展，腎移植成功率不斷提高，腎移植已成為治療終末期腎病(Endstagerenaldisease，ESRD)的有效方法。但臨床腎移植過程中，移植腎在切取、灌注、保存等過程中不可避免的要發(fā)生一定程度的損傷，其中缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是最重要的，并且在早期移植腎組織活檢發(fā)現缺血再灌注損傷與促炎癥狀態(tài)有關，與移植物長期存活以及排斥反應的發(fā)生有直接的關系。研究證實在I/R中，

2、核因子-κB(NF-κB)的激活起了重要的作用。NF-κB是一種重要的轉錄因子，研究顯示NF-κB廣泛參與多種炎性因子基因的轉錄表達的調控，可導致細胞的過渡活化并誘發(fā)損傷。Sung等研究發(fā)現在腎臟缺血期NF-κB就被激活，并且在再灌注的15min時達到高峰，NF-κB對組織的早期的炎癥起重要作用。
　　近年的研究發(fā)現，促紅素(Erythropoietin，EPO)除了對造血系統(tǒng)的造血作用外，EPO在各種器官的缺血再灌注損傷中有顯著

3、的組織保護作用，包括腎、心臟、肝臟和中樞神經系統(tǒng)等，證實在缺血再灌注前后給予促紅素可起到保護作用。在腎臟中，研究發(fā)現應用EPO可以減輕腎臟的缺血再灌注損傷，促紅素具有很好的抗炎、抗凋亡作用，并且這些保護作用是劑量依賴的，從而對腎臟起到即刻保護作用。EPO保護組織的可能的機制是通過受體與配體結合相互作用的方式來發(fā)揮其效用的。在缺血狀態(tài)下，EPO受體表達將會顯著增加。EPO在細胞內可以有多種信號傳導途徑。已發(fā)現EPO可以激活NF-κB，并且

4、目前發(fā)現的可能參與EPO組織保護作用的信號分子途徑有多種，如PI3/Akt，JAK2及MAPKs等均可引起NF-κB的活化，EPO的受體復合物((erythropoietinreceptro，EPO-R)包括2個經典型的(EPOR)2和2個β型的受體βcR2(β-commonreceptor,βcR)。EPO與傳統(tǒng)的EPO同源二聚受體(EPOR)2結合能力要比具有保護性亞單位的EPOR2-βcR2的結合能力強，因此啟動組織的保護作用需給

5、予更高劑量的EPO。但高劑量EPO帶來的副作用也是很明顯的，如心血管事件發(fā)生率增加、血栓形成的風險增加、腫瘤細胞的生長等，因此限制了其在臨床中對保護組織的廣泛應用。MBrines等研究發(fā)現在小鼠心肌細胞上存在保護性受體亞單位βcR(CD131)，能與EPO受體亞單位，EPO-R形成異源二聚受體復合物，通過激活不同的信號通路，進而發(fā)揮減輕炎性反應、抗細胞調亡，對組織和器官發(fā)揮保護作用，但不啟動造血信號通路的傳導，因此為了避免EPO的不良反

6、應，各種的EPO衍生物研發(fā)能獨立于促紅素的傳統(tǒng)的結合位點而和EPOR2-βcR2受體復合物結合發(fā)揮組織保護作用。ARA290是最新的EPO類似物衍生肽，含有11種氨基酸序列，在空間上組成線性多肽，能獨立于促紅作用位點而發(fā)揮組織保護作用。目前有少量的研究證實，ARA290在腎、腦缺血再灌注損傷中都有很好的組織保護作用，并且沒有高劑量EPO帶來的明顯的副作用。
　　盡管上述對ARA290的研究已取得初步進展，并且表現出了很好的組織保護

7、作用，但應用ARA290預處理供體供腎并且觀察其在移植后移植腎早期損傷中的作用研究尚未見報道。因此本研究擬模擬臨床腎移植條件及過程，將ARA290加入UW器官保存液中，在4℃低溫保存條件下對供腎進行預處理，并建立異體大鼠腎移植模型，觀察移植術后對腎臟的保護作用，應用分子生物學方法檢測移植術后移植腎炎性因子mRNA的表達以及可能的NF-κB的信號機制，探討應用促紅素衍生肽ARA290處理腎移植供體，提高供體質量、減輕移植腎早期損傷，從而取

8、得臨床上較好的腎移植療效。
　　第一部分:體外部分促紅素衍生肽ARA290對內皮細胞低溫缺氧復氧損傷中的保護作用及NF-κB的機制研究
　　目的
　　觀察ARA290對人臍靜脈內皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)低溫缺氧復氧損傷中的保護作用，探討ARA290預處理內皮細胞保護作用的NF-κB機制。
　　方法
　　1.建立HUVEC細胞低溫缺氧復氧模型;并

9、隨機分為四組:①對照組(Control):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時后，更換不含血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10小時;②缺氧/復氧組(H/R):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時后，更換不含血清的1640培養(yǎng)液低溫缺氧保存6h/復氧4小時;③ARA290組:10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時后，更換經含10nmol/ml的ARA290的UW器官保存液;④UW器官保存液組(UW

10、):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時后，更換UW器官保存液并低溫缺氧保存6h/復氧4小時。
　　2.MTT比色法檢測細胞活力、AnnxeniV/FITC，PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　3.用RT-PCR技術測定內皮細胞VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、IL-6和MCP-1的mRNA表達。
　　4.用EMSA方法測定各組低溫缺氧/復氧損傷后HUVEC細胞NF-κB結合活性。<

11、br>　　結果
　　1.Control組的細胞存活率為97.3±6.8％，而經低溫缺氧復氧損傷后的H/R組細胞存活率明顯下降，只有71.4±5.9％，和control組比較(P＜0.01);而經ARA290預處理組的內皮細胞存活率略低于control組，存活率為89.5±7.1％(P＜0.05)，有統(tǒng)計學差異，而顯著高于UW組和H/R組(P＜0.01)，統(tǒng)計學有顯著差異。UW組內皮細胞存活率為76.3±6.0％與H/R組無差異(P

12、＞0.05)。
　　2.細胞凋亡率H/R組13.13±0.94％、control組1.15±0.18％、ARA290組5.34±0.61％、UW組的11.45±0.71％，ARA290預處理組的細胞凋亡率，和其余三組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR結果顯示，經ARA290預處理組ICAM-1、VCAM-1、IL-6、MCP-1及P-selectin的mRNA表達與H/R組相比明顯下降，分別下降了(65

13、.19±3.18)％、(71.53±5.13)％、(68.53±4.81)％、(51.09±4.17)％、(45.24±3.79)％，差異有顯著意義(P＜0.01)，而UW組各組內皮細胞的因子mRNA表達未被抑制，略低于H/R組因子的mRNA表達，兩組間比較統(tǒng)計學無差異(P＞0.05);H/R組上述因子mRNA表達與Control組相比，分別上升了（10.58±1.17）倍、（22.03±3.74）倍、(13.29±1.87)倍、（29

14、.13±3.15）倍、（19.15±2.18）倍，統(tǒng)計學上具有顯著差異(P＜0.01)。
　　4.NF-κBDNA結合活性EMSA法結果顯示:Control組有較弱的表達，RDU為1.20±0.11;H/R組RDU為58.31±5.17，與control組及ARA290組比較有顯著差異((P＜0.01)。ARA290預處理組的RDU為8.69±1.14，明顯低于UW組的RDU約為50.61±3.73，統(tǒng)計學上有顯著差異(P＜0.0

15、1)。同時在特異性競爭實驗即在H/R組中，加入未標記的特異性探針及未標記非特異性探針SP-1競爭，其RDU值分別為1.55±0.23和54.3±1.60。
　　結論
　　1.在低溫缺氧復氧損傷中，HUVEC上調了相關的趨化因子及粘附分子的mRNA表達水平。
　　2.促紅素衍生肽ARA290可對HUVEC細胞的低溫缺氧復氧損傷有保護作用，可抑制其凋亡，降低了粘附分子及趨化因子的mRNA表達水平。
　　3.促紅素衍生

16、肽ARA290預處理可抑制NF-κB的活化。
　　第二部分:在體研究促紅素衍生肽ARA290減輕大鼠移植腎早期損傷及機制研究
　　目的
　　探討應用促紅素衍生肽ARA290預處理腎移植供體，提高供體質量、減輕大鼠移植腎早期損傷。
　　方法
　　1.建立大鼠異體腎移植模型，將促紅素衍生肽ARA290加入UW器官保存液中對供體器官進行預處理，將大鼠隨機分為3組:每組6只:(1)Sham組（假手術組），SD大鼠開

17、腹后，即將傷口縫合，24h后切取左腎;(2)UW組，供腎經UW灌注及低溫缺氧保存6h，移植到受體大鼠24h后切取移植腎;(3)ARA290組供腎經含10nmol/Kg的UW低溫缺氧保存6h，移植到受體大鼠24h后切取移植腎。
　　2.觀察ARA290對移植大鼠腎功能及腎組織形態(tài)學的保護作用。
　　3.應用免疫組織化學法觀察炎性細胞對移植腎早期的浸潤，并觀察ARA290對其影響。
　　4.應用分子生物學方法RT-PCR等

18、方法檢測移植術后移植腎組織炎性因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及RANTES的mRNA表達，并觀察ARA290對其影響。
　　5應用EMSA法檢測NF-κB的DNA結合活性，探討其保護移植腎早期損傷的可能機制。
　　結果:
　　1.ARA290組的血肌酐值為180.28±32.06μmmol/L，而UW組的為319.48±35.02μmmol/L(P＜0.01)，Sham組的為32.15±7.08μmmol/

19、L，而ARA組則明顯低于UW組(P＜0.01);同樣，ARA290組尿素氮水平明顯低于UW組(19.48±3.81vs.31.19±9.17mmol/L，P＜0.01)，而UW組則明顯高于Sham組(31.19±9.17vs.4.21±0.69mmol/L,P＜0.01)
　　2.UW組的移植腎組織受損嚴重，其主要表現為腎小管結構破壞消失，上皮細胞腫脹、脫落、刷狀緣丟失，可見核固縮，腎小管擴張、管腔阻塞，并伴有炎性細胞浸潤;經AR

20、A290預處理供體腎臟后，與UW組相比，移植腎的損傷程度則有明顯改善;
　　3.UW組可見大量的巨噬細胞在腎小血管間質浸潤;而與ARA290組相比，經ARA290處理組則在小管間質區(qū)域偶見巨噬細胞，減少了的浸潤。
　　4.與Sham組相比，UW組移植腎的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平明顯升高(P＜0.05);與UW組和相比，經ARA290處理的移植腎MCP-1、ICAM-1、VCAM-1

21、、及RANTES的mRNA水平顯著下降(P＜0.01)。
　　5.ARA290組NF-κB的DNA結合活性略高于Sham組（1.016±0.28VS0.54±0.30），差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與UW組相比(51.35±3.18VS1.16±0.38)，顯著抑制(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.促紅素衍生肽ARA290對大鼠移植腎具有保護作用，可顯著減輕移植腎早期的巨噬細胞在腎小管、間質的浸潤，減輕形態(tài)