飽和氫氣生理鹽水對(duì)大鼠肝移植術(shù)后急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究飽和氫氣生理鹽水對(duì)大鼠原位肝移植術(shù)后急性腎損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討自噬參與其腎臟保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠56只，周齡8~10周，體重220~250 g，采取隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組（n=8）：假手術(shù)組、大鼠原位肝移植模型組（OLT組）、飽和氫氣生理鹽水處理組（HS組）及氯喹預(yù)處理組（CQ組），其中假手術(shù)組8只，其它三組均為8對(duì)。假手術(shù)組行單純開(kāi)關(guān)腹操作，并游離相應(yīng)血管和肝周韌帶；大鼠原位肝

2、移植模型組建立大鼠原位肝移植模型，并于無(wú)肝期前5 min經(jīng)下腔靜脈緩慢注射生理鹽水6 ml/kg；飽和氫氣生理鹽水處理組于無(wú)肝期前5 min經(jīng)下腔靜脈緩慢注射飽和氫氣生理鹽水6 ml/kg，其它操作同大鼠原位肝移植模型組；氯喹預(yù)處理組于模型建立前1 h經(jīng)腹腔注射自噬特異性抑制劑氯喹60 mg/kg，其它處理同飽和氫氣生理鹽水處理組。再灌注后6 h抽取靜脈血樣和腎組織檢測(cè)血清學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）水平評(píng)

3、價(jià)腎功能情況，測(cè)定腎組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性評(píng)價(jià)腎臟氧化應(yīng)激程度，通過(guò)伊紅-美藍(lán)（HE）染色于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變，并行腎小管損傷評(píng)分；采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色法定量檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)活化的caspase-3、細(xì)胞色素c（Cyt c）等凋亡相關(guān)mRNA的表達(dá)水平；通過(guò)蛋白免疫印跡法（west

4、ern blot）檢測(cè)磷酸化 p53（p-53）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin-1、活化的caspase-3和細(xì)胞色素c（Cyt c）等自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；并且通過(guò)透射電子顯微鏡觀察自噬小體和自噬溶酶體的形成情況以及腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組比較，OLT組腎功能顯著降低，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡及管型，腎小管損傷評(píng)分增加，腎臟氧化應(yīng)激水平升高，細(xì)胞凋亡明顯增加，凋亡指數(shù)升高，活化的

5、caspase-3和Cyt c的表達(dá)水平顯著上調(diào)，p53磷酸化、LC3Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與OLT組比較，HS組大鼠腎功能明顯改善，腎組織空泡樣改變減少，腎小管損傷評(píng)分降低，腎臟氧化應(yīng)激損傷減輕，細(xì)胞凋亡明顯減少，凋亡指數(shù)降低，并且活化的caspase-3和Cyt c的表達(dá)水平顯著降低，與此同時(shí)，p53磷酸化、LC3Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)明顯上調(diào)，透射電鏡下可見(jiàn)自噬小體和自噬溶酶體的形成增加；與HS組比較

6、，CQ組大鼠腎功能降低，腎組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重，腎小管損傷評(píng)分和凋亡指數(shù)升高，腎臟氧化應(yīng)激水平升高，細(xì)胞凋亡增加，活化的caspase-3和Cyt c的表達(dá)水平上調(diào)， LC3Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)下調(diào)，p53磷酸化的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用氯喹抑制自噬后部分抵消了飽和氫氣生理鹽水的腎臟保護(hù)效應(yīng)。
　　結(jié)論：飽和氫氣生理鹽水可通過(guò)調(diào)控p53磷酸化的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的激活，并且自噬激活通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡、減輕腎臟氧化