c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布作用于肝膽管結(jié)石并膽管癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　探討COX-2和C-Met在肝膽管結(jié)石合并膽管癌組織中，二者的組織表達(dá)情況;觀察PF-2341066及塞來昔布聯(lián)合作用于膽管癌細(xì)胞株QBC939及膽管癌裸鼠荷瘤模型的實(shí)驗(yàn)效果;探討HGF—c-Met—COX-2—PGE2—VEGF是否為促進(jìn)膽管癌血管生成的一個(gè)潛在信號(hào)通路;探討c-Met抑制劑PF-2341066及COX-2抑制劑塞來昔布的聯(lián)合使用能否為該類腫瘤未來的治療策略提供一種新的靶點(diǎn)治療方案。
　　方法：

2、
　　1.Western blot法、RT-PCR檢測(cè)膽管癌組織中c-Met、COX-2的表達(dá)，分析其與該疾病臨床病理征之間的關(guān)系。
　　2.c-Met和COX-2的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后關(guān)系的分析方法:c-Met和COX-2的表達(dá)水平與肝膽管結(jié)石并膽管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)分析;二者與患者預(yù)后關(guān)系采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析模型(Cox pr

3、oportional hazards model)進(jìn)行分析。
　　3.MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長:體外培養(yǎng)膽管癌QBC939細(xì)胞株，然后用c-Met抑制劑PF-2341066聯(lián)合塞來昔布進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:體外培養(yǎng)膽管癌QBC939細(xì)胞株，然后用c-Met抑制劑PF-2341066聯(lián)合塞來昔布進(jìn)行干預(yù)，采用AnnexinⅤ-EGFP和PropidiumIodide染色，染色后采用流式細(xì)胞儀

4、進(jìn)行分析，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　5.構(gòu)建裸鼠荷瘤模型，采用PF-2341066聯(lián)合塞來昔布對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.c-Met、COX-2在肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中的蛋白表達(dá)均為最高，其在癌旁組織中的表達(dá)又比在肝膽管結(jié)石膽管組織及正常組織中高，組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2.肝膽管結(jié)石并膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2表達(dá)水平明顯

5、與膽管癌的腫瘤分期有關(guān)，腫瘤分期為Ⅲ和Ⅳ期的膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2表達(dá)明顯高于分期為Ⅰ和Ⅱ期的膽管癌組織(P＜0.05); c-Met和COX-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有顯著的相關(guān)性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的膽管癌組織(P＜0.05);此外已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶患者的膽管癌組織中c-Met和COX-2表達(dá)水平也明顯高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的膽管癌組織（P＜0.05）;由此可見，c

6、-Met和COX-2在膽管癌的臨床進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮了重要作用。
　　3.采用Cox多因素回歸分析膽管癌患者的預(yù)后相關(guān)因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌組織中c-Met和COX-2表達(dá)高的患者預(yù)后更差，提示c-Met、COX-2的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，c-Met與COX-2可能是膽管癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。此外統(tǒng)計(jì)分析提示，腫瘤的分期（P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P＜0.05）和遠(yuǎn)處是否存在轉(zhuǎn)移灶(P＜0.05）同樣是膽管癌

7、患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。
　　4.使用膽管癌細(xì)胞株QBC939進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，采用不同濃度的c-Met抑制劑作用QBC939細(xì)胞后，檢測(cè)其增殖與凋亡的變化，結(jié)果顯示QBC939細(xì)胞的增殖抑制率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高，并且發(fā)現(xiàn)在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組中的細(xì)胞增殖抑制率最高，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。同樣方法處理細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀對(duì)QBC939細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，QBC939的

8、細(xì)胞凋亡率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高，并且發(fā)現(xiàn)在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組中的細(xì)胞凋亡率最高，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5.采用不同濃度的c-Met抑制劑作用QBC939細(xì)胞株后，對(duì)細(xì)胞的c-Met、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)c-Met、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達(dá)水平隨c-Met抑制劑的濃度增加而降低，并在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)

9、合用藥組中的表達(dá)最低，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　6.構(gòu)建裸鼠荷瘤模型，采用c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布干預(yù)荷瘤裸鼠后，對(duì)腫瘤體積大小進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積隨c-Met抑制劑濃度增加而減小，PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的腫瘤平均體積最小，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　7.采用不同濃度的c-Met抑制劑對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行干預(yù)作用后，檢測(cè)其腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的變化。結(jié)果顯

10、示，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高，并且在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的增殖抑制率最高，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。同樣方法處理細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高，并且在聯(lián)合用藥組的凋亡率最高，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　8.采用不同濃度的c-Met抑制劑對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行干預(yù)作用后，對(duì)腫瘤組織的

11、c-Met、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)c-Met、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達(dá)水平隨c-Met抑制劑濃度的增加而降低，并在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的表達(dá)最低，與對(duì)照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中c-Met及COX-2的表達(dá)較癌旁組織、正常膽管組織明顯升高，提示二者在肝膽管結(jié)石并膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要

12、的作用。
　　2、肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中c-Met及COX-2的表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶有明顯的相關(guān)性，因此推測(cè)二者可能與肝膽管結(jié)石并膽管癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　3、使用c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布能夠降低荷瘤裸鼠腫瘤體積，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，推測(cè)c-Met及COX-2可能是影響膽管癌腫瘤進(jìn)展的重要因素。
　　4、c-Met及COX-2的抑制劑可能是肝膽管結(jié)石并膽管癌未來潛在的靶點(diǎn)藥物，有望