JIP3介導(dǎo)TrkB受體順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)及增強(qiáng)BDNF引發(fā)的信號(hào)通路激活的功能研究.pdf

1、研究背景
　　 神經(jīng)元作為一種高度極化的細(xì)胞，通常由胞體、一條軸突和若干條樹(shù)突組成，通過(guò)這些軸突和樹(shù)突來(lái)與周圍細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系；因此各種蛋白分子在神經(jīng)元突起中的精確定位對(duì)于神經(jīng)元的功能是非常重要的。目前已知，蛋白分子在神經(jīng)元軸突和樹(shù)突中的長(zhǎng)距離順向轉(zhuǎn)運(yùn)(由胞體向遠(yuǎn)端)主要是由沿著微管運(yùn)行的分子馬達(dá)kinesin介導(dǎo)的。其中，在神經(jīng)元中起到多種功能的運(yùn)載體的亞型是傳統(tǒng)型kinesin(kinesin-1)，它是由兩條重鏈(kinesi

2、n heavy chain，KHC)和兩條輕鏈(kinesin lightchain，KLC)組成。目前發(fā)現(xiàn)的能夠與kinesin-1結(jié)合的許多種可溶性的銜接蛋白通過(guò)與kinesin-1結(jié)合從而介導(dǎo)一些膜結(jié)合運(yùn)載物來(lái)通過(guò)kinesin-1沿著微管運(yùn)動(dòng)。但是，目前尚不清楚在神經(jīng)元當(dāng)中哪些運(yùn)載蛋白是通過(guò)kinesin-1來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)的。
　　 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophins，NTS)是一類對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋

3、白質(zhì)，其成員包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4(NT-4)等，在神經(jīng)元的存活、分化、神經(jīng)突起的形成以及調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路的功能中起到重要的作用。尤其是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)在活性依賴的突觸功能的變化中起到極為關(guān)鍵的作用。靶組織中分泌的BDNF與位于神經(jīng)元軸突末梢的TrkB受體結(jié)合后可激活受體進(jìn)行逆向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因

4、此，神經(jīng)元中的TrkB受體在細(xì)胞體內(nèi)正確的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及定位對(duì)于BDNF信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。TrkB受體在神經(jīng)細(xì)胞里沿著軸突和樹(shù)突順向轉(zhuǎn)運(yùn)(從胞體向神經(jīng)細(xì)胞末梢方向)需要由kinesin-1來(lái)介導(dǎo)。但是，TrkB受體在神經(jīng)元軸突和樹(shù)突中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是否相同目前還尚不清楚。目前已有報(bào)道，TrkB受體在神經(jīng)元中是由Rab27B/Slp1/CRMP-2這個(gè)銜接復(fù)合體介導(dǎo)與kinesin-1結(jié)合從而進(jìn)行順向轉(zhuǎn)運(yùn)的。但是，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，敲除掉這個(gè)銜接

5、復(fù)合體中的任何蛋白只能使到達(dá)軸突末梢的TrkB受體減少30-50％，說(shuō)明TrkB受體在神經(jīng)元中的順向轉(zhuǎn)運(yùn)還存在有其他的機(jī)制。
　　 JNK相互作用蛋白3(JNK-interacting protein3；JIP3)在腦組織中廣泛表達(dá)，在神經(jīng)元當(dāng)中分布于樹(shù)突、核周體以及神經(jīng)元軸突。JIP3最初作為一種JNK相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)，并且以支架蛋白的方式引發(fā)特異的氨基末端激酶信號(hào)分子。后續(xù)的基因?qū)W研究表明，JNK相互作用蛋白3(JIP3)

6、是果蠅Sunday driver以及線蟲(chóng)UNC-16的一種同源體。上述兩種都是在依賴kinesin的順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)中作為銜接蛋白的，作為它們的同源體，JIP3是否也能作為銜接蛋白介導(dǎo)某種蛋白與kinesin結(jié)合進(jìn)行順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)呢?已有文獻(xiàn)報(bào)道，JNK3能夠與JIP3結(jié)合從而沿著軸突進(jìn)行順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，而JIP3能否和其他的運(yùn)載物直接結(jié)合并且介導(dǎo)它們的順向轉(zhuǎn)運(yùn)還不清楚。
　　 研究目的:
　　 1.研究TrkB受體順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，

7、是否有特異的銜接蛋白介導(dǎo)
　　 2.TrkB受體在神經(jīng)元軸突和樹(shù)突中順向轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制是否相同
　　 3.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的調(diào)控是否能影響到BDNF引起的后續(xù)信號(hào)通路，甚至對(duì)神經(jīng)元生理功能產(chǎn)生影響
　　 研究方法:
　　 1.經(jīng)典坐骨神經(jīng)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)
　　 坐骨神經(jīng)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)是一種很成熟的能夠從生化水平和免疫組化水平鑒定軸突內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的分子的體內(nèi)試驗(yàn)方法，因?yàn)樽巧窠?jīng)組織中富含有長(zhǎng)軸突和一部分施旺細(xì)胞，對(duì)于研究體

8、內(nèi)的軸突物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是很好的方法。成年雄性大鼠麻醉后，將其一側(cè)坐骨神經(jīng)用5-0線結(jié)扎，一天后，取結(jié)扎口附近的坐骨神經(jīng)提取蛋白進(jìn)行western blot試驗(yàn)檢測(cè)其中的蛋白的水平，并取對(duì)照的未結(jié)扎的坐骨神經(jīng)組織提取蛋白作為對(duì)照組，比較其蛋白水平差異，從而進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)分析。亦可將結(jié)扎口附近組織取材縱向冰凍切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析其中的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)。
　　 2.免疫熒光分析方法
　　 海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)第5天，用4％

9、多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗3次后0.4％Triton透化10分鐘，再次PBS洗后用10％山羊血清封閉一小時(shí)，然后加一抗4攝氏度孵育過(guò)夜，PBS洗3次后加熒光二抗，最后PBS洗后加防熒光粹滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的定位情況，并用MetaMorph軟件進(jìn)行熒光定量分析。
　　 3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析蛋白蛋白相互作用
　　 HEK293細(xì)胞電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48小時(shí)，用加有合適濃度的蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，

10、裂解液在4攝氏度條件下以14000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心15分鐘，在可溶性的上清蛋白混合液中加入一抗孵育，4攝氏度2小時(shí)以上，然后用結(jié)合有細(xì)菌蛋白A或者蛋白G的瓊脂糖珠子與蛋白復(fù)合體充分混合，由于蛋白A或者蛋白G能夠特異的與人和哺乳動(dòng)物抗體(主要是IgG)的FC區(qū)結(jié)合，所以就能形成相互作用蛋白復(fù)合體/抗體/蛋白A或蛋白G/瓊脂糖珠子復(fù)合體了。經(jīng)低速離心收集結(jié)合了蛋白A或者蛋白G的瓊脂糖珠子，用細(xì)胞裂解液洗去非特異性結(jié)合的蛋白后，就可以進(jìn)行S

11、DS-PAGE電泳，westernblot蛋白印跡分析相互作用的蛋白了。
　　 為了研究體內(nèi)蛋白相互作用，取大鼠大腦勻漿，提取蛋白，測(cè)濃度后，每個(gè)反應(yīng)管在10mg總蛋白中加入內(nèi)源性JIP3一抗孵育，用結(jié)合有蛋白G的瓊脂糖珠子4攝氏度充分結(jié)合蛋白復(fù)合體，經(jīng)低速離心收集后可以進(jìn)行SDS-PAGE電泳，westernblot蛋白印跡，用內(nèi)源性TrkB、KLC1抗體檢測(cè)相互作用了。也可以反過(guò)來(lái)，用內(nèi)源性KLC1抗體進(jìn)行一抗孵育，同樣步驟

12、，最后用JIP3、TrkB抗體檢測(cè)相互作用。
　　 4.GST融合蛋白沉降技術(shù)
　　 表達(dá)TrkB受體JM區(qū)的JM1(454-465)；JM2(454-485)；JM3(454-508)；JM(454-537)的cDNA片段被克隆入pGEX-4T-1載體，純化出帶有GST探針的純化蛋白能夠與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合，His-JIP3-CC1(amino acids451-520)蛋白表達(dá)和純化后與上述結(jié)合有GST探針融合蛋白

13、的谷胱甘肽瓊脂糖珠充分孵育，以使蛋白結(jié)合。獲得的混合物經(jīng)洗滌后，用過(guò)量游離的谷胱甘肽洗脫，煮沸，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白結(jié)合或者用His抗體免疫印跡法分析蛋白結(jié)合。
　　 5.活細(xì)胞成像技術(shù)
　　 用于進(jìn)行活細(xì)胞成像的海馬神經(jīng)元取材后計(jì)數(shù)用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染帶有熒光的TrkB質(zhì)粒后在用PDL鋪板的玻璃底皿中培養(yǎng)5天，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞放置在尼康TE2000熒光顯微鏡下用40倍油鏡觀察，選擇具有較健康的形態(tài)的神

14、經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行觀察。每一秒拍攝一張熒光照片共拍攝一分鐘記錄囊泡的運(yùn)動(dòng)，用Metamorph軟件對(duì)囊泡運(yùn)動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。順向運(yùn)動(dòng)，逆向運(yùn)動(dòng)，雙向運(yùn)動(dòng)以及靜止不動(dòng)的囊泡的運(yùn)動(dòng)速度被計(jì)算出來(lái)。每次實(shí)驗(yàn)中都要記錄和統(tǒng)計(jì)至少80到120個(gè)囊泡的運(yùn)動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)求平均值，數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，且這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次以上。
　　 6.絲狀偽足計(jì)數(shù)
　　 絲狀偽足被定義為神經(jīng)元上長(zhǎng)度小于10微米的小突起，因?yàn)槲覀?/p>

15、使用的神經(jīng)元是培養(yǎng)5天的神經(jīng)元，樹(shù)突棘還未長(zhǎng)出。絲狀偽足的計(jì)數(shù)是在每個(gè)處理組中隨機(jī)選取35個(gè)以上的神經(jīng)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其軸突和若干個(gè)樹(shù)突上一段30至80微米長(zhǎng)度的距離上絲狀偽足的個(gè)數(shù)，然后算出其密度值(個(gè)數(shù)/10微米)，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，最后將其密度值用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.TrkB受體兩種亞型(TrkB-FL和TrkB.T1)在大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)都有順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)
　　 成年大鼠坐骨神經(jīng)中

16、段結(jié)扎一天后，取結(jié)扎口附近的坐骨神經(jīng)提取蛋白進(jìn)行western blot試驗(yàn)檢測(cè)其中的TrkB-FL和TrkB.T1的水平發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于非結(jié)扎側(cè)坐骨神經(jīng)，TrkB-FL的量在結(jié)扎口的近端增多(代表順軸突轉(zhuǎn)運(yùn))，在結(jié)扎口的遠(yuǎn)端也增多(代表逆向軸突轉(zhuǎn)運(yùn))。從而驗(yàn)證了以前文獻(xiàn)的報(bào)道：TrkB受體既存在順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)也存在逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，還發(fā)現(xiàn)TrkB受體的截短突變體TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶區(qū))也能夠進(jìn)行順向轉(zhuǎn)運(yùn)，有文獻(xiàn)報(bào)道，TrkB受體可

17、以通過(guò)其酪氨酸激酶區(qū)與Slp1/Rab27B/CRMP-2/kinesin-1結(jié)合而進(jìn)行順向軸突轉(zhuǎn)運(yùn)(1)，而本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TrkB受體的截短突變體TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶區(qū))也能夠進(jìn)行順向轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明了存在有不依賴于TrkB受體的酪氨酸激酶的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制存在；目前已知TrkB受體與其截短突變體TrkB.T1在近膜區(qū)有12個(gè)氨基酸序列是完全相同的，而這12個(gè)氨基酸也許在TrkB受體順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中起到關(guān)鍵性的作用。通過(guò)用TrkB受體全長(zhǎng)

18、型與TrkB.T1的共同12個(gè)氨基酸序列做成誘餌進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了35個(gè)陽(yáng)性克隆，其中3種都是編碼JIP3蛋白的(結(jié)果未顯示)。而JIP3蛋白已被發(fā)現(xiàn)在依賴于kinesin-1的順向轉(zhuǎn)運(yùn)中起到銜接蛋白的作用，因此我們推測(cè)JIP3蛋白能夠介導(dǎo)TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 2.JIP3與TrkB在體外與體內(nèi)都存在有部分共定位
　　 首先將海馬神經(jīng)元細(xì)胞體外培養(yǎng)5天，用免疫熒光法看內(nèi)源性JIP3與TrkB在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)

19、的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明：含有TrkB受體的囊泡分布于體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的核周區(qū)域以及軸突和樹(shù)突分布區(qū)，且與JIP3的分布情況存在部分共定位。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)的共定位情況，我們將大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎一天后，取材切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察到TrkB受體在結(jié)扎口近端有明顯的聚集，且與JIP3蛋白有較多共定位。
　　 然后我們用免疫共沉淀法檢測(cè)JIP3與TrkB是否形成復(fù)合體。①在HEK29細(xì)胞中過(guò)表達(dá)各種質(zhì)粒并進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果

20、顯示Flag-TrkB-FL和Flag-TrkB.T1都可以和HA-JIP3形成復(fù)合體；但是同等量的情況下Flag-TrkB.T1與HA-JIP3結(jié)合比Flag-TrkB-FL結(jié)合要弱。②我們還進(jìn)行了生理?xiàng)l件下的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)JIP3與TrkB是否形成一個(gè)復(fù)合體。取大鼠大腦勻漿，用內(nèi)源性JIP3抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，然后用內(nèi)源性KLC1抗體、內(nèi)源性TrkB抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明TrkB/JIP3/KLC1形成一個(gè)復(fù)合體。

21、
　　 3.JIP3是介導(dǎo)TrkB與KLC1結(jié)合的銜接蛋白，并與二者形成TrkB/JIP3/KLC1復(fù)合體
　　 為了研究究竟哪個(gè)分子是介導(dǎo)TrkB與KLC1結(jié)合的中間橋梁，我們進(jìn)行3個(gè)分子共表達(dá)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：JIP3是介導(dǎo)TrkB與KLC1結(jié)合的銜接蛋白，但敲除掉JIP3表達(dá)時(shí)，TrkB與KLC1結(jié)合并未完全消失；而同時(shí)敲除JIP3和Rab27B時(shí)，TrkB-FL與KLC1的結(jié)合能力比單敲除掉JIP3或者

22、單敲除掉Rab27B時(shí)降低的更多。以上結(jié)果表明：TrkB-FL既可以通過(guò)JIP3蛋白的銜接作用與KLC1相互作用，也可以通過(guò)Sip1/Rab27B/CRMP-2復(fù)合體與KLC1相互作用，這兩種方式是同時(shí)存在的。
　　 4.TrkB受體中與JIP3蛋白結(jié)合的精確區(qū)域是近膜1區(qū)的12個(gè)氨基酸，它們是TrkB受體與JIP3蛋白結(jié)合的必要條件和充分條件
　　 為了研究TrkB受體中與JIP3蛋白結(jié)合的精確區(qū)域，我們構(gòu)建了以下Tr

23、kB突變體：JM區(qū)只含有這12個(gè)氨基酸的突變體FlagTrkB-JM1，JM區(qū)完全缺失的突變體FlagTrkB-JM0，以及僅缺失這12個(gè)氨基酸的缺失突變體FlagTrkB△JM1。免疫共沉淀結(jié)果表明：TrkB-JM1不僅是TrkB/JIP3結(jié)合的必要條件，同樣也是TrkB/JIP3結(jié)合的充分條件。而嫁接了TrkB-JM2，TrkB-JM3后能增強(qiáng)TrkB/JIP3的結(jié)合，從而解釋了之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(同等量的情況下TrkB.T1與JIP3

24、結(jié)合比-FL結(jié)合要弱)。
　　 眾所周知，酪氨酸激酶受體有常見(jiàn)的三種形式：TrkA，TrkB，TrkC。因此我們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)研究JIP3蛋白是否與這3種受體都有相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：JIP3除了與TrkB受體結(jié)合以外，還能與TrkC受體結(jié)合，而不與TrkA結(jié)合。
　　 5.JIP3蛋白分別通過(guò)其CC1區(qū)域和LZ區(qū)域與TrkB受體和KLC1結(jié)合，且JIP3CC1與TrkBJM1區(qū)域是直接結(jié)合的
　　 為了尋找

25、JIP3蛋白中與TrkB受體結(jié)合的的精確區(qū)域，我們構(gòu)建了一系列的JIP3缺失突變體，并且用免疫共沉淀方法檢測(cè)其與TrkB-FL受體結(jié)合的能力。結(jié)果表明：JIP3蛋白的424-625氨基酸序列對(duì)JIP3蛋白和TrkB受體的結(jié)合起到關(guān)鍵性作用。這段氨基酸序列中包含有3個(gè)保守序列，分別是：亮氨酸拉鏈區(qū)(leucine Zipper-like domain，LZ)，環(huán)區(qū)1(coiled-coil1，CC1)，環(huán)區(qū)2(coiled-coil2，C

26、C2)。為了尋找更加精確的結(jié)合區(qū)域，我們構(gòu)建了分別缺失LZ，CC1，CC2的JIP3突變體，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：JIP3蛋白分別通過(guò)其CC1區(qū)域和LZ區(qū)域與TrkB受體和KLC1分子馬達(dá)結(jié)合。且缺失了CC1區(qū)域JIP3蛋白能夠作為一個(gè)功能缺失的突變體(dominant negative，DN)來(lái)研究JIP3對(duì)TrkB受體的轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)。
　　 為了驗(yàn)證TrkB與JIP3是直接結(jié)合而非間接的，我們運(yùn)用體外的GST融合蛋白沉降技術(shù)

27、來(lái)檢測(cè)TrkB/JIP3的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：JIP3-CC1區(qū)域能夠直接與TrkB-JM1區(qū)域結(jié)合；TrkB-JM2，TrkB-JM3之間的區(qū)域能夠增強(qiáng)這種結(jié)合作用，這與我們之前的免疫共沉淀結(jié)果是相符合的。
　　 6.JIP3蛋白介導(dǎo)了TrkB受體在神經(jīng)元軸突中的順向轉(zhuǎn)運(yùn)而不影響樹(shù)突中的順向轉(zhuǎn)運(yùn)
　　 前面我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：TrkB/JIP3/KLC1形成一個(gè)復(fù)合體，我們猜測(cè)JIP3蛋白能夠介導(dǎo)TrkB受體利用K

28、LC1進(jìn)行順向轉(zhuǎn)運(yùn)。為證實(shí)此猜想，我們用免疫熒光法檢測(cè)過(guò)表達(dá)JIP3，或者敲除掉內(nèi)源性JIP3對(duì)TrkB-FL-GFP在分化的PC12細(xì)胞末梢的分布的影響。在該實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組(轉(zhuǎn)染隨機(jī)無(wú)意義干擾RNA組)中，TrkB-FL-GFP可以聚集到分化的PC12細(xì)胞末梢，而轉(zhuǎn)染特異性針對(duì)JIP3序列的干擾RNA(siJIP3)或者JIP3的功能缺失體JIP3△CC1后，到達(dá)分化的PC12細(xì)胞末梢的TrkB-F-GFP顯著減少。與之相反，過(guò)表達(dá)JI

29、P3能夠顯著增加到達(dá)分化的PC12細(xì)胞末梢的TrkB-FL-GFP量。以上結(jié)果表明：JIP3能夠促進(jìn)分化的PC12細(xì)胞中TrkB-FL-GFP的順向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 為了研究?jī)?nèi)源性表達(dá)的TrkB受體，在神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)運(yùn)是否能夠被JIP3增強(qiáng)，我們?cè)隗w外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元中重復(fù)了以上實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)JIP3能夠使得轉(zhuǎn)運(yùn)到軸突末梢的TrkB受體顯著增多，反之亦然，過(guò)表達(dá)JIP3的功能缺失體JIP3△CC1或者轉(zhuǎn)染了siJIP3

30、能夠使得轉(zhuǎn)運(yùn)到軸突末梢的TrkB受體明顯減少，而以上3種處理方式對(duì)于到達(dá)樹(shù)突末梢的TrkB受體不受影響。同時(shí)敲除JIP3和Rab27B，與單獨(dú)敲除JIP3或Rab27B組相比，可以使到達(dá)軸突末梢的TrkB受體減少到更低。這再次驗(yàn)證了之前的結(jié)果，即TrkB-FL既可以通過(guò)JIP3蛋白的銜接作用與KLC1相互作用，也可以通過(guò)Slp1/Rab27B/CRMP-2復(fù)合體與KLC1相互作用，這兩種機(jī)制是同時(shí)存在的，且是亞相加(subadditiv

31、e)的。
　　 7.活細(xì)胞成像結(jié)果：JIP3對(duì)軸突中TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)起特異性作用，而對(duì)樹(shù)突中TrkB受體運(yùn)動(dòng)無(wú)影響
　　 為了進(jìn)一步研究JIP3對(duì)TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，我們將神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染TrkB-FL-mRFP后體外培養(yǎng)五天，用熒光顯微鏡觀測(cè)含有TrkB-FL-mRFP的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果顯示囊泡在神經(jīng)元軸突中運(yùn)動(dòng)更加活躍，可以見(jiàn)到囊泡沿著軸突進(jìn)行順向、逆向、雙向轉(zhuǎn)運(yùn)以及靜止不動(dòng)，而在樹(shù)突中運(yùn)動(dòng)要相對(duì)少的多。

32、為了便于定量分析，我們?nèi)藶榈膶⒑蠺rkB-FL-mRFP的囊泡在神經(jīng)元中的運(yùn)動(dòng)情況可以分為四類：(1)順向轉(zhuǎn)運(yùn)的，(2)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的，(3)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的，(4)相對(duì)靜止不動(dòng)的。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：(1)軸突和樹(shù)突中以上四種運(yùn)動(dòng)方式的囊泡所占比例大致相似。(2)與對(duì)照組相比，siJIP3組中含有TrkB-FL-mRFP的囊泡進(jìn)行順向軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的比例明顯減少，而軸突中靜止不動(dòng)的囊泡比例相應(yīng)升高。(3)siJIP3組中樹(shù)突中的4種囊泡的比例不變。以上結(jié)

33、果表明：JIP3特異性的對(duì)軸突中TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)起作用，而對(duì)樹(shù)突中TrkB受體運(yùn)動(dòng)無(wú)影響。
　　 8.依賴于JIP3的TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)于BDNF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用
　　 為了研究JIP3介導(dǎo)的TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于后續(xù)功能的影響，我們研究了JIP3是否影響B(tài)DNF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入50ng/mlBDNF15分鐘，來(lái)激活Erk1/2是一種很好的建立的TrkB受體激活的方法。由于神經(jīng)元細(xì)

34、胞的轉(zhuǎn)染效率低，我們用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)BDNF激活的磷酸化的Erk1/2(p Erk1/2)。敲除掉內(nèi)源性JIP3后，在總Erk1/2水平不變的情況下，磷酸化Erk1/2水平降低了大約35％，反之，在過(guò)表達(dá)JIP3組中，Erk1/2磷酸化水平升高了大約40％。JIP3對(duì)于BDNF誘導(dǎo)的Erk1/2磷酸化水平的影響，在軸突末梢處比整個(gè)細(xì)胞的影響更為明顯。
　　 9.JIP3不能夠促進(jìn)TrkB受體的細(xì)胞膜表面插入
　　

35、 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以前的文獻(xiàn)報(bào)道(2)，我們使用了TrkB受體細(xì)胞膜表面分布比例的熒光定量方法：海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染Flag-TrkB-FL-GFP，以及各組質(zhì)粒ScramblesiRNA，HAJIP3，siJIP3，siRab27B，并觀察神經(jīng)元軸突末梢總的TrkB量以及膜表面的TrkB量的變化情況。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)JIP3或者敲除掉JIP3能夠使得軸突遠(yuǎn)端的總TrkB-FL以及膜表面的TrkB-FL都相應(yīng)的增多或者減少，而不論何種干預(yù)，Tr

36、kB-FL膜表面/總量的比值保持不變。以上結(jié)果表明：順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的TrkB-FL能夠成功插入到膜表面而且JIP3對(duì)TrkB受體的膜表面插入無(wú)顯著影響。
　　 10.JIP3能夠影響B(tài)DNF作用下海馬神經(jīng)元軸突上絲狀偽足的形成
　　 已有文獻(xiàn)表明(3)，BDNF/TrkB信號(hào)能夠驅(qū)動(dòng)活性依賴的突觸形態(tài)發(fā)生。為了研究JIP3依賴的TrkB轉(zhuǎn)運(yùn)在BDNF引發(fā)的突觸形態(tài)發(fā)生中的作用，我們研究了JIP3是否能調(diào)節(jié)BDNF刺激引起的絲

37、狀偽足形成。將海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染Scramble siRNA，siJIP3，JIP3△CC1，JIP3FL后，用BDNF刺激20分鐘，然后固定細(xì)胞檢測(cè)絲狀偽足的形成情況并加以統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：siJIP3組和JIP3△CC1組的BDNF刺激后絲狀偽足沒(méi)有明顯增加，而過(guò)表達(dá)JIP3組BDNF刺激后軸突上絲狀偽足數(shù)目明顯增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與之相反，JIP3對(duì)于樹(shù)突上絲狀偽足數(shù)目的增加沒(méi)有任何調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果表明，JIP3可以選擇性影

38、響軸突上絲狀偽足的形成，且是由于JIP3對(duì)BDNF信號(hào)的影響來(lái)調(diào)控的。
　　 結(jié)論:
　　 1、JIP3是介導(dǎo)TrkB與KLC1結(jié)合的銜接蛋白，并與其形成TrkB/JIP3/KLC1復(fù)合體。
　　 2、TrkB受體中與JIP3蛋白結(jié)合的精確區(qū)域是近膜區(qū)的12個(gè)氨基酸，它們是TrkB受體與JIP3蛋白結(jié)合的必要條件和充分條件。
　　 3、JIP3蛋白的CC1區(qū)域和LZ區(qū)域分別與TrkB與KLC1結(jié)合，且JI

39、P3-CC1區(qū)域與TrkB-JM1區(qū)域是直接結(jié)合的。
　　 4、JIP3蛋白介導(dǎo)了TrkB受體在神經(jīng)元軸突中的順向轉(zhuǎn)運(yùn)，而不影響樹(shù)突中的順向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 5、依賴于JIP3的TrkB受體順向轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)于BDNF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用。創(chuàng)新點(diǎn)
　　 創(chuàng)新點(diǎn)一，本研究中首次發(fā)現(xiàn)：JIP3能夠直接與TrkB受體結(jié)合并且將TrkB受體與驅(qū)動(dòng)蛋白kinesin-1相連接從而沿著微管進(jìn)行順向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)二，JIP