TCDCA對(duì)TGR5介導(dǎo)的信號(hào)通路中AMP含量的影響.pdf

1、體內(nèi)活性物質(zhì)牛磺鵝去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic Acid，TCDCA)作為膽汁酸的主要有效成分之一，具有顯著地抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。為了深入探討TCDCA的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。本文分析了TCDCA對(duì)TGR5介導(dǎo)的信號(hào)通路中cAMP含量的影響。其主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1) NR8383細(xì)胞TGR5基因阻斷模型建立的研究
　　采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將TGR5 siRNA轉(zhuǎn)染到NR8383細(xì)胞中。實(shí)時(shí)

2、熒光定量PCR和Western Blot分別檢測(cè)了NR8383細(xì)胞中TGR5 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TGR5 siRNA組NR8383細(xì)胞上的TGR5 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），TGR5 siRNA的沉默率可達(dá)80％。
　　(2)穩(wěn)定表達(dá)TGR5受體NR8383細(xì)胞系的建立
　　將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcMV-TGR5轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞，加入G418篩選了表達(dá)TGR5的NR8383細(xì)胞

3、系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了NR8383細(xì)胞系中TGR5的表達(dá)。結(jié)果顯示，建立的NR8383細(xì)胞系中能夠穩(wěn)定表達(dá)TGR5。
　　(3) TCDCA對(duì)TGR5受體基因沉默及穩(wěn)定表達(dá)的NR8383細(xì)胞中cAMP含量的影響
　　采用ELISA法分別檢測(cè)了TCDCA作用后TGR5基因阻斷的NR8383細(xì)胞(TGR5-/-)及穩(wěn)定表達(dá)TGR5受體的NR8383細(xì)胞中cAMP的含量。結(jié)果表明:

4、一定劑量（濃度）的TCDCA能夠使轉(zhuǎn)染TGR5受體的NR8383細(xì)胞產(chǎn)生cAMP。加之不同濃度的TCDCA刺激低表達(dá)TGR5受體的NR8383和TGR5受體沉默的NR8383細(xì)胞后，均未顯著影響這2種細(xì)胞中的cAMP含量，因而提示，TCDCA誘導(dǎo)NR8383-TGR5細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高的效應(yīng)與其激動(dòng)TGR5有關(guān)。
　　(4) TCDCA對(duì)AC阻斷后NR8383-TGR5細(xì)胞中cAMP含量的影響
　　通過(guò)ELISA法檢測(cè)了

5、TGR5受體介導(dǎo)的AC-cAMP信號(hào)通路中AC被阻斷后，TCDCA對(duì)穩(wěn)定表達(dá)TGR5受體的NR8383細(xì)胞中cAMP的含量。結(jié)果顯示，在AC特異性抑制劑SQ22，536抑制NR8383-TGR5中的AC活性后，不同濃度的TCDCA對(duì)NR8383-TGR5細(xì)胞中cAMP的含量均無(wú)顯著影響。提示TCDCA對(duì)NR8383-TGR5細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響，與AC的活性有關(guān)。
　　(5) TCDCA對(duì)PDE4阻斷后NR8383-TGR5細(xì)

6、胞中cAMP含量的影響
　　通過(guò)ELISA法檢測(cè)了TGR5受體介導(dǎo)的AC-cAMP信號(hào)通路中PDE4被阻斷后，TCDCA對(duì)穩(wěn)定表達(dá)TGR5受體的NR8383細(xì)胞中cAMP的含量。結(jié)果顯示，在PDE4特異性抑制劑Rolipram抑制PDE活性后，NR8383-TGR5細(xì)胞內(nèi)cAMP水平蓄積的基礎(chǔ)上，10μM及100μM濃度的TCDCA仍均能極顯著的提高cAMP的含量。提示，TCDCA引起NR8383-TGR5細(xì)胞中cAMP含量的增加

7、，與其激動(dòng)TGR5，參與了AC-cAMP信號(hào)通路有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究的主要結(jié)論如下:
　　(1)通過(guò)RNA干擾技術(shù)成功建立了NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TGR5基因阻斷模型;
　　(2)成功建立了穩(wěn)定表達(dá)TGR5基因的NR8383細(xì)胞系;
　　(3)TCDCA對(duì)低表達(dá)TGR5受體的NR8383和TGR5受體沉默的NR8383細(xì)胞中的cAMP含量均未產(chǎn)生顯著影響;TCDCA降低NR8383-TGR5細(xì)胞內(nèi)cAMP