激動(dòng)TGR5對(duì)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：研究激動(dòng)TGR5對(duì)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響，并探討可能存在的機(jī)制。
　　方法：⑴原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞(cfs)及鑒定:取3-5天乳小鼠，處死后取心臟的心尖部分，胰酶消化后用差速貼壁法培養(yǎng)7-10天左右傳代，取3代細(xì)胞用特異性抗體熒光免疫法鑒別。⑵熒光定量PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞上TGR5 mRNA表達(dá):提取生長(zhǎng)良好的3代心肌成纖維細(xì)胞的RNA，同時(shí)分別提取肝臟、脾臟和心臟組織的RNA用于對(duì)比，檢測(cè)RNA

2、的濃度及純度后，進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，委托上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)、合成TGR5引物，上機(jī)進(jìn)行目的基因的定量檢測(cè)。⑶TGR5過表達(dá)慢病毒的制備與包裝:利用限制性內(nèi)切酶消化后得到線性化載體。PCR擴(kuò)增制備目的基因片段。以GV358作為工具載體質(zhì)粒，同Helper1.0質(zhì)粒及Helper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48-72 h后進(jìn)行病毒收獲，離心濃縮和純化后得到高滴度的慢病毒，分裝保存，并進(jìn)行病毒質(zhì)量檢測(cè)。⑷TGR5過表達(dá)慢病毒感染

3、心肌成纖維細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞膜上TGR5表達(dá):取3代生長(zhǎng)良好的心肌成纖維細(xì)胞，分為正常細(xì)胞組、空病毒組、TGR5過表達(dá)慢病毒組(cfs-v)，孵育24h，熒光顯微鏡下觀察熒光顯色并用PCR法檢測(cè)細(xì)胞膜上TGR5 mRNA的表達(dá)變化，用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGR5的蛋白水平。⑸小鼠膠原蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型:用吸管分別吸取各組培養(yǎng)基于10ml離心管中，離心后得到上清液，加入酶標(biāo)板中，經(jīng)溫育、洗滌、顯色、終

4、止、測(cè)定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。⑹cAMP試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)cAMP含量:胰酶消化收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍存，使細(xì)胞內(nèi)成分完全裂解，離心后取上清液，加入酶標(biāo)板中，經(jīng)溫育、洗滌、加酶、顯色、終止、測(cè)定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。⑺探索激動(dòng)TGR5影響膠原蛋白分泌的機(jī)制:實(shí)驗(yàn)分組:空白組（cfs組）；對(duì)照組（cfs-v組）；cfs-v+nomilin組；cfs-v+nomilin+BIRB-

5、796組。取2代cfs及cfs-v接種于6孔板上，正常培養(yǎng)2天，當(dāng)貼璧細(xì)胞達(dá)到90％時(shí)加入含BIRB-796的培養(yǎng)基（BIRB-796終濃度為10μmol/l）干預(yù)1小時(shí)，然后加入諾米林(nomilin)（50mmol/l，20μl/孔）作用24小時(shí)。分別提取上述各組細(xì)胞的總蛋白及核蛋白，運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定得到蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次孵育一抗和二抗、顯色、成像后，將獲得圖像用圖像

6、處理軟件ImageJ測(cè)定并分析條帶灰度值以檢測(cè)p-P38、Nrf2、HO-1的蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞成功。②熒光定量PCR結(jié)果顯示:cfs上TGR5 mRNA的表達(dá)量明顯少于心臟、肝臟和脾臟，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。③成功制備TGR5過表達(dá)慢病毒:克隆測(cè)序結(jié)果證實(shí)目標(biāo)基因成功連接入酶切載體。檢測(cè)病毒滴度為2E+8TU/ml。④成功建立過表達(dá)TGR5的心肌成纖維細(xì)胞模型：熒光顯微鏡下可見感

7、染TGR5過表達(dá)慢病毒的心肌成纖維細(xì)胞(cfs-v)有大量熒光表達(dá)，感染率為90％；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:cfs-v上TGR5 mRNA表達(dá)量較cfs明顯增多，P＜0.05；Western Blot結(jié)果顯示:cfs-v內(nèi)TGR5的蛋白含量較cfs明顯增多，P＜0.05。5、cAMP試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)cAMP含量的結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞內(nèi)cAMP含量較cfs組及cfs-v組均明顯升高，P值均＜0.05。6、ELISA試

8、劑盒檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型的結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白較cfs組及cfs-v組均明顯降低，P值均＜0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796組與cfs-v+nomilin組相比，膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ的含量增多，P＜0.05。7、Western Blot法檢測(cè)各組內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平，結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平較