PMPs通過CXCR2介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)RA-FLS的遷移、侵襲.pdf

1、目的:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳的形成、軟骨及骨侵蝕破壞為主要病理改變的一種病因尚未明確的慢性炎癥性自身免疫系統(tǒng)疾病。隨著對(duì)RA疾病研究的深入，發(fā)現(xiàn)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)遷移及侵襲能力的增強(qiáng)在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。血小板微顆粒（Platelet microparticles，PMPs）是血小板活化后脫落的胞膜顆粒。本課題組前期工作及文獻(xiàn)報(bào)道顯示RA

2、患者外周血與關(guān)節(jié)腔中PMPs均異常增高，且PMPs的水平與RA疾病活動(dòng)性相關(guān)，提示PMPs在RA的疾病的發(fā)生及發(fā)展中起一定作用。我們前期工作已發(fā)現(xiàn)PMPs可通過激活NF-κB通路，上調(diào)RA-FLS中MMP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了RA-FLS遷移及侵襲。本研究的目的是明確PMPs中促進(jìn)RA-FLS遷移、侵襲的主要活性成份，并探究其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A)，采用流式細(xì)胞儀以FIT

3、C標(biāo)記的鼠抗人CD90、PE標(biāo)記的鼠抗人CD55抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　2.選取新鮮機(jī)采富血小板血漿，使用ADP活化血小板，提取PMPs，并使用流式細(xì)胞儀以PE標(biāo)記的鼠抗人CD41抗體進(jìn)行純度測(cè)定，進(jìn)行定量。
　　3.通過蛋白質(zhì)譜分析PMPs中的主要成分。
　　4.應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)各種趨化因子受體拮抗劑對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響。
　　5.利用細(xì)胞劃痕、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)探究各種趨化因

4、子受體拮抗劑對(duì)PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移、侵襲能力的影響。
　　6.通過高通量基因芯片檢測(cè)PMPs對(duì)RA-FLS中相關(guān)基因表達(dá)的影響。使用RT-qPCR從mRNA水平、Western Blot從蛋白水平驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果。
　　7.使用Western Blot方法研究PMPs促進(jìn)RA-FLS遷移、侵襲的主要活性成份及其作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.流式細(xì)胞儀鑒定MH7A的CD90、CD55的陽性表達(dá)率為

5、95.6±1.36％(n=3)，確定其性質(zhì)，可用于后期實(shí)驗(yàn)。
　　2.流式細(xì)胞儀鑒定，提取的PMPs純度達(dá)93.4±1.46％(n=3)，可用于后期實(shí)驗(yàn)。
　　3.PMPs蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示PMPs中含有5256種蛋白，GO分析表明這些蛋白質(zhì)涉及到生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能和信號(hào)通路等方面。PMPs中含有多種與細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)的趨化因子，如CCL5、CCL23、CXCL4及CXCL7等。
　　4.CCK-8細(xì)胞

6、活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)選擇的受體拮抗劑BX471(CCR1拮抗劑)、AMG487（CXCR3拮抗劑）、STI571（CXCR3拮抗劑）、SB225002（CXCR2拮抗劑）對(duì)細(xì)胞活力均無明顯影響（P＞0.05）。
　　5.細(xì)胞劃痕、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明BX471、AMG487、STI571對(duì)PMPs促進(jìn)RA-FLS遷移的作用無明顯影響(P＞0.05);SB225002具有部分阻斷PMPs促進(jìn)RA-FLS遷移的作用(

7、P＜0.05)。
　　6.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明SB225002具有部分阻斷PMPs促進(jìn)RA-FLS侵襲的作用（P＜0.05）。
　　7.高通量基因芯片檢測(cè)顯示25μg/ml及50μg/ml PMPs明顯上調(diào)了RA-FLS中CXCL5的mRNA的表達(dá)。RT-qPCR、Western Blot檢測(cè)證實(shí)PMPs可上調(diào)RA-FLS中CXCL5的表達(dá)(P＜0.05)。
　　8.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S

8、B225002可下調(diào)RA-FLS中p-IκB、p-NF-κB(P＜0.05);PMPs一方面可以下調(diào)RA-FLS中IκB的表達(dá)，另一方面可以上調(diào)RA-FLS中p-IκB的表達(dá)，而SB225002+50μg/ml PMPs組與50μg/ml PMPs組相比上調(diào)RA-FLS中IκB的表達(dá)，且下調(diào)RA-FLS中p-IκB的表達(dá)(P＜0.05);PMPs可上調(diào)RA-FLS中p-NF-κB的表達(dá)，SB225002+50μg/ml PMPs組與50