蘆薈多糖通過(guò)VEGFR-2介導(dǎo)的Ras信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制.pdf

1、目的：探討蘆薈多糖通過(guò)VEGFR-2介導(dǎo)Ras信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及促進(jìn)小鼠深Ⅱ度創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。
　　方法：1、體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）隨機(jī)分為兩組-蘆薈多糖組和對(duì)照組，蘆薈多糖組為HUVEC分別經(jīng)100,200和400mg/L濃度蘆薈多糖作用，未經(jīng)蘆薈多糖作用為對(duì)照組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖狀況，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；AO-EB染色法檢測(cè)蘆薈多糖對(duì)細(xì)胞毒副作

2、用；LDH漏出率檢測(cè)蘆薈多糖對(duì)細(xì)胞損傷程度。
　　2、蘆薈多糖組和對(duì)照組HUVECs進(jìn)行逐級(jí)信號(hào)阻斷：⑴加入SU5416半數(shù)抑制劑量(IC50)阻斷VEGFR-2；⑵加入U(xiǎn)73122完全阻斷PLC-γ后，用FPP IC50阻斷Ras；⑶以不加抑制劑作為抑制劑對(duì)照組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖狀況，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中VEGF和VEGFR-2水平，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中VEGFR-2、Ras、Raf以及Ras和R

3、af磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　3、150只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n=144）,實(shí)驗(yàn)組小鼠于背部制作直徑2cm深Ⅱ度燙傷模型，并隨機(jī)細(xì)分為四個(gè)處理組(每個(gè)處理組36只)，創(chuàng)面分別用0.5％蘆薈多糖霜、SD-Ag霜、基質(zhì)霜和生理鹽水處理，觀察創(chuàng)面愈合情況，并于傷后1,3,7,10,14和21d取創(chuàng)面組織,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)VEGF和VEGFR-2水平。
　　結(jié)果：1、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示蘆薈多糖作

4、用后HUVEC增殖與對(duì)照組比較均較為活躍，并于第5天達(dá)峰值；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變；蘆薈多糖作用后G0/G1期細(xì)胞所占百分率顯著下降，而G2/M期和S期細(xì)胞所占百分率顯著上升（P<0.01）；AO-EB染色結(jié)果未發(fā)現(xiàn)凋亡或死亡細(xì)胞；各組LDH漏出率也無(wú)明顯改變。
　　2、⑴與對(duì)照組比較，200和400mg/L蘆薈多糖組培養(yǎng)上清液中VEGF水平顯著上升（P<0.05-0.01），細(xì)胞Ras磷酸化蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0

5、.05）；100,200和400mg/L蘆薈多糖組VEGFR、Ras和Raf蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)（P<0.05-0.01）。
　?、婆c不加抑制劑的蘆薈多糖組和對(duì)照組比較，加入IC50 SU5416作用48h后相對(duì)應(yīng)各組HUVEC增殖明顯下降，培養(yǎng)上清液中VEGF水平顯著上升（P<0.05-0.01），細(xì)胞VEGFR-2、Ras和Ras磷酸化蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.05-0.01）；但與抑制劑對(duì)照組比較，200和400mg/L蘆薈

6、多糖組細(xì)胞增殖明顯上升（P<0.01）；100,200和400mg/L蘆薈多糖組培養(yǎng)上清液中VEGF水平顯著上升（P<0.05），而VEGFR-2水平只有200mg/L蘆薈多糖組差異具有顯著性意義（P<0.05）；100,200和400mg/L蘆薈多糖組細(xì)胞VEGFR-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05-0.01），200和400mg/L蘆薈多糖組細(xì)胞Ras和Ras磷酸化蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。
　?、桥c不加抑制劑的蘆薈多

7、糖組和對(duì)照組比較，加入IC50 FPP作用48h后相對(duì)應(yīng)各組細(xì)胞增殖明顯下降（P<0.01），細(xì)胞Ras、Raf及其磷酸化蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.05-0.01）；但與抑制劑對(duì)照組比較，200和400mg/L蘆薈多糖組細(xì)胞增殖明顯上升（P<0.01）；100,200和400mg/L蘆薈多糖組細(xì)胞Ras、和Raf蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01），它們磷酸化蛋白呈上升趨勢(shì)。
　　3、與SD-Ag組、基質(zhì)組和生理鹽水組比較，蘆薈多糖

8、組傷后10、14和21d創(chuàng)面愈合明顯增快（P<0.05）。蘆薈多糖組傷后1、3、7和21d創(chuàng)面組織中VEGF水平與生理鹽水組比較顯著增加（P<0.05-0.01）；而與SD-Ag組和基質(zhì)組比較，蘆薈多糖組傷后3、7和21d創(chuàng)面組織中VEGF水平也顯著性上升（P<0.05-0.01）。蘆薈多糖組傷后7、10、14和21d創(chuàng)面組織中VEGFR-2水平與生理鹽水組比較顯著增加，而與SD-Ag組和基質(zhì)組比較，蘆薈多糖組傷后14和21d創(chuàng)面組織中

9、VEGFR-2水平呈顯著性增加（P<0.05-0.01）。
　　結(jié)論：蘆薈多糖能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，且無(wú)毒性，它促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，并增強(qiáng)由VEGFR-2介導(dǎo)Ras信號(hào)通路中VEGFR-2、Ras、Raf和Ras磷酸化蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)蘆薈多糖促進(jìn)深Ⅱ度燙傷小鼠創(chuàng)面組織產(chǎn)生VEGF，并能增強(qiáng)創(chuàng)面組織中VEGFR-2表達(dá)，加速創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果表明蘆薈多糖在由VEGFR-2介導(dǎo)Ras信號(hào)通