抵擋湯早期干預對2型糖尿病大鼠大血管內皮細胞MLCK信號通路的調控作用.pdf

1、目的：
　　本課題通過觀察大鼠胸主動脈的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A(PKA)的表達水平，及各組大鼠血管內皮細胞光鏡和電鏡下的變化，探討 MLCK信號通路在糖尿病血管內皮細胞中的調控作用，旨在揭示抵擋湯早期干預可以通過介導 MLCK信號通路改變血管內皮細胞通透性，為臨床預防糖尿病大血管并發(fā)癥提供新的思路及理論依據(jù)。通過觀察抵擋湯早、中、晚組實驗療效的不同，進一步詮釋中醫(yī)治未

2、病思想。
　　方法：
　　1.動物造模
　　選取健康的SD雄性大鼠150只，適應性飼養(yǎng)1周后，從中隨機抽取20只作為空白對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余130只作為造模組，給予高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，內眥靜脈取血，檢測空腹血糖(FBG)和血清胰島素水平(Ins)。在造模組大鼠中隨機選取20只作為抵擋湯早期干預組，第8周開始給予抵擋湯灌胃，12周后開始造模。動物出現(xiàn)胰島素抵抗后，除空白對照組予以相同劑量的枸櫞酸緩沖液外，其余

3、大鼠均予以鏈脲佐菌素（STZ）30mg/kg尾靜脈注射。3天后于大鼠尾靜脈處采血檢測隨機血糖，若血糖高于16.7mmol/L，則為造模成功。前期實驗成模116只（成模率約89％），除抵擋湯早期干預組（造模前4周給藥），其余大鼠按體重、血糖分層隨機分成糖尿病組、抵擋湯中期給藥組（成模時給藥）、抵擋湯晚期給藥組（成模后4周給藥）、二甲雙胍組、辛伐他汀組。
　　2.檢測指標
　　于24周將大鼠處死，取其胸主動脈組織，存放于凍存管內

4、，備用。用Western-Blot方法檢測MLCK的表達水平；實時熒光定量PCR方法檢測cAMP、PKC、PKA的表達水平的變化，HE染色后觀察各組大鼠胸主動脈形態(tài)學結構變化，并在電鏡下觀察血管內皮細胞及內皮細胞間連接的超微結構。
　　結果：
　?。?）成模后，與空白對照組比較，造模組體重和血糖明顯升高，胰島素敏感指數(shù)降低。與糖尿病組比較，抵擋湯早、中干預組cAMP、PKA均升高，MLCK、PKC表達下降，有顯著差異（P<0

5、.05）；與抵擋湯晚期干預組比較，抵擋湯早期干預組 cAMP、PKA、MLCK、PKC改變更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；抵擋湯早期干預組與辛伐他汀組比較，無顯著差異（P>0.05）。
　?。?）觀察主動脈組織HE染色變化：空白對照組大鼠動脈內膜相對完整、光滑，平滑肌細胞及彈力膜結構排列規(guī)則，平滑肌細胞未見明顯變性；糖尿病組大鼠動脈內膜增厚，內皮細胞排列不完整，大部分內皮細胞缺失，部分平滑肌細胞變性、壞死，炎細胞浸潤；

6、抵擋湯早期干預組和辛伐他汀組大鼠的動脈內膜相對光滑，內皮細胞局部缺失，平滑肌細胞及彈力膜結構排列規(guī)則；抵擋湯中、晚期干預組和二甲雙胍組動脈內膜不完整，部分內皮細胞缺失，平滑肌細胞及彈力膜排列紊亂，伴少量平滑肌細胞變性、壞死。
　　（3）空白對照組的電鏡結果顯示內皮細胞完整，形成的緊密連接連續(xù)、致密，寬度在30-40nm之間，平滑肌細胞完整；糖尿病組內皮細胞很薄不連續(xù)，細胞輪廓變的不清楚，彈力膜厚度不一且不均勻，平滑肌細胞線粒體腫脹

7、；抵擋湯早期干預組和辛伐他汀組細胞間連接較糖尿病組連續(xù)、致密，彈力膜增厚，平滑肌細胞正常；抵擋湯中、晚期干預組，二甲雙胍組內皮細胞增厚，彈力膜厚度不一，平滑肌細胞完整。
　　結論：
　　抵擋湯早期干預可以調節(jié)血管內皮通透性改變，減輕血管內皮細胞損傷，增強血管內皮的防御功能，從而延緩糖尿病大血管病變的發(fā)生與發(fā)展。其機制可能為：抵擋湯早期干預可以提高cAMP、PKA的表達，降低PKC、MLCK的表達，從而調控MLCK信號通路，介