2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  利用肺炎衣原體(Chlamdia pneumoniae,C.pneumoniae)體外感染血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)模型,觀察C.pneumoniae感染對VEC遷移和血管新生的影響;探討IQGAP1-N-WASP信號(hào)通路在C.pneumoniae感染誘導(dǎo)VEC遷移和血管新生中的作用。
  方法:
  1.C.pneumoniae增殖培養(yǎng)后體外感染VEC;

2、r>  2.采用Western blot技術(shù)檢測C.pneumoniae感染的VEC內(nèi)IQGAP1蛋白的表達(dá)水平;
  3.免疫共沉淀法檢測C.pneumoniae感染后IQGAP1的磷酸化水平;
  4.CCK-8檢測Src抑制劑PP2以及PKC抑制劑GF109203X和chelerythrine在使用濃度及作用時(shí)間內(nèi)對VEC活力的影響;
  5.免疫熒光法確定PP2、GF109203X以及chelerythrine

3、在使用濃度及作用時(shí)間內(nèi)對C.pneumoniae感染率的影響;
  6.分別用PP2、GF109203X和chelerythrine預(yù)處理后,免疫共沉淀法檢測C.pneumoniae感染后IQGAP1酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平的變化;
  7.用PP2、GF109203X和chelerythrine分別抑制IQGAP1的酪氨酸和絲氨酸磷酸化,wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)與微管腔實(shí)驗(yàn)觀察各組VEC遷移能

4、力和血管新生能力的改變;
  8.肌動(dòng)蛋白聚合實(shí)驗(yàn)觀察C.pneumoniae感染VEC后IQGAP1與肌動(dòng)蛋白的功能性定位;
  9.免疫共沉淀確定IQGAP1與N-WASP之間的相互作用;
  10.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使IQGAP1表達(dá)水平下調(diào),Western blot檢測IQGAP1的蛋白表達(dá)以確定干擾效能;
  11.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使IQGAP1表達(dá)水平下調(diào),共聚焦顯微鏡觀察C.pneumoniae感

5、染后VEC內(nèi)肌動(dòng)蛋白和N-WASP的共定位情況,Western blot檢測C.pneumoniae感染后VEC中N-WASP磷酸化水平。
  結(jié)果:
  1.C.pneumoniae感染VEC后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IQGAP1蛋白表達(dá)水平與0h比較無明顯變化;
  2.C.pneumoniae感染VEC10h和24h后,IQGAP1絲氨酸和酪氨酸磷酸化水平均明顯高于正常對照組(P<0.05),感染后24h IQGAP1絲氨酸

6、磷酸化水平高于10h(P<0.05),而10h和24h時(shí)間點(diǎn)之間的酪氨酸磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
  3.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,分別與正常對照組相比1μmol/L PP2、1μmol/L GF109203X和5μmol/L chelerythrine在作用時(shí)間內(nèi)對VEC活力無明顯影響,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
  4.使用PP2、GF109203X以及chelerythrine預(yù)處理的各組V

7、EC的C.pneumoniae感染率無明顯差異,而且此感染率與C.pneumoniae感染組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);
  5.感染24h后,C.pneumoniae感染+PP2組VEC的IQGAP1酪氨酸磷酸化水平明顯低于單純C.pneumoniae感染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),C.pneumoniae感染+GF109203X組以及C.pneumoniae感染+chelerythrine組VEC的IQGAP

8、1絲氨酸磷酸化水平也均明顯低于單純C.pneumoniae感染組(P<0.05);
  6.Wound healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PP2、GF109203X和chelerythrine預(yù)處理的C.pneumoniae感染組VEC向劃痕中央遷移的面積明顯小于單純C.pneumoniae感染組(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PP2、GF109203X和chelerythrine預(yù)處理的C.pneumoniae感染組

9、VEC穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于單純C.pneumoniae感染組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;微管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常對照組相比,C.pneumoniae感染后VEC形成微管腔結(jié)構(gòu)的能力明顯增強(qiáng)(P<0.05),但是,經(jīng)PP2、GF109203X和chelerythrine預(yù)處理后C.pneumoniae感染的這種效應(yīng)則明顯減弱(P<0.05);
  7.C.pneumoniae感染后VEC內(nèi)肌絲聚合,且在細(xì)胞“l(fā)eadin

10、g edge”處聚集增多;IQGAP1聚集于肌絲聚合處,呈重合狀態(tài);
  8.C.pneumoniae感染VEC10h后,免疫共沉淀結(jié)果顯示,在65kDa處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,符合N-WASP蛋白的分子量大小;
  9.siRNA轉(zhuǎn)染后48h,三個(gè)濃度組的IQGAP1蛋白表達(dá)水平均明顯下降,分別為正常對照組的18.27%、17.33%和17.18%;
  10.共聚焦顯微鏡觀察,C.pneumoniae感染后VEC內(nèi)肌

11、絲聚合,N-WASP與肌絲共定位于細(xì)胞“l(fā)eading edge”處,而沉默IQGAP1的表達(dá)后該效應(yīng)受到抑制。與正常對照組相比,C.pneumoniae感染組N-WASP磷酸化水平明顯升高(P<0.05),而沉默IQGAP1的表達(dá)后,N-WASP磷酸化水平則顯著降低,低于C.pneumoniae感染組(P<0.05)。
  結(jié)論:
  C.pneumoniae感染可能是通過促使IQGAP1的酪氨酸位點(diǎn)和絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化

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