HIF-1α促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生。 1997 年Asahara 等在Science 上發(fā)表的文章提出：人外周血中分離得到的EPC 在體外培養(yǎng)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞并表達(dá)內(nèi)皮特異性成分，在裸鼠下肢缺血模型中EPC 可參與新生血管的形成，這一發(fā)現(xiàn)為缺血性疾病提供了新的輔助治療手段，此后，國(guó)際上對(duì)于外周血EPC 移

2、植促血管新生的研究始終方興未艾。但是由于循環(huán)血中EPC 數(shù)量不足,限制了EPC 的廣泛應(yīng)用。因此，如何通過(guò)各種措施增加EPC 數(shù)量已經(jīng)成為目前研究的焦點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在低氧環(huán)境中起細(xì)胞調(diào)控作用的關(guān)鍵基因, 在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用，但HIF-1α與干細(xì)胞尤其是EPC 的關(guān)系尚不清楚。 本研究分四部分試圖探討HIF-1α轉(zhuǎn)染到EPC 后的變化

3、，HIF-1α在EPC中的過(guò)表達(dá)是否有助于進(jìn)一步促進(jìn)EPC 的血管新生作用，為EPC 在促進(jìn)血管新生和治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用方面提供理論基礎(chǔ)和新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分，HIF-1α轉(zhuǎn)染EPC 的初步探討。 目的：建立人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化方法，觀察電穿孔轉(zhuǎn)染HIF-1α至EPC 后，EPC 在體外向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)分化的性質(zhì)、擴(kuò)增及遷移功能改變及對(duì)體內(nèi)缺血

4、下肢血管新生的影響。 方法：密度梯度離心法分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)、分化、擴(kuò)增EPC 并鑒定。分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HIF-1α特異性干擾質(zhì)粒（siHIF-1α），電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染HIF-1α或其干擾質(zhì)粒，觀察基因修飾的EPC 形態(tài)學(xué)及功能學(xué)改變。 結(jié)果：體外培養(yǎng)所的EPC 7 天后CD34

5、+約30％，AC133+約10％，CD31+約33％,細(xì)胞保持EC 前體細(xì)胞特性并可定向向EC 分化；EPC內(nèi)的HIF-1α mRNA 在常氧及低氧下有表達(dá)，但其蛋白表達(dá)在常氧中不穩(wěn)定。電穿孔轉(zhuǎn)染GFP 空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率約25％，低氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染HIF-1α后的EPC 中HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表達(dá)升高，可被特異性siHIF-1α中度抑制; 功能學(xué)檢測(cè)示HIF-1α過(guò)表達(dá)增加了EPC在體外的分化、擴(kuò)增、遷移；EC 標(biāo)記物C

6、D31、VEGFR2、eNOS 及VEGF、NO 分泌增加；移植HIF-1α?EPC 至缺血下肢后可見(jiàn)外源性EPC 存在于缺血部位； HIF-1α?EPC 較對(duì)照組進(jìn)一步促進(jìn)體內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)目增加。 結(jié)論：在體外，HIF-1α修飾的EPC 不影響其前體細(xì)胞性質(zhì)，可促進(jìn)EPC 擴(kuò)增及遷移功能改善；在體內(nèi)，HIF-1α?EPC 有助于促進(jìn)缺血下肢的局部血管新生。 第二部分，腺病毒介導(dǎo)HIF-1α體外感染EPC 的實(shí)驗(yàn)研究。

7、 目的：改進(jìn)轉(zhuǎn)染方法，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)HIF-1α至EPC，提高了感染效率，觀察腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α在EPC 中的過(guò)表達(dá)是否在體外有利于促進(jìn)EPC 的成血管活性。 方法：在體外構(gòu)建人HIF-1α基因腺病毒載體(Ad-HIF-1α)及其siRNA 抑制載體(Ad-si HIF-1α)；通過(guò)腺病毒介導(dǎo)人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC，觀察感染后EPC 在體外的擴(kuò)增及遷移功能改變。 結(jié)果：以MOI

8、 為70 感染各組細(xì)胞6 h 后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率80％以上并持續(xù)至少1 月，未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡；感染Ad-HIF-1α后的EPC 在體外細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)成倍增加，遷移功能改善(P<0.05)，感染Ad-siHIF-1α后的EPC 擴(kuò)增及遷移功能受抑制。 結(jié)論：在體外，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的方法基因修飾EPC 初步認(rèn)為高效，細(xì)胞損傷小，體外Ad-HIF-1α感染EPC 增加了EPC 的成血管活性，為進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定

9、了基礎(chǔ)。 第三部分，Ad-HIF-1α-EPC 對(duì)裸鼠缺血下肢血管新生的影響。 目的：觀察腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α在EPC 中的過(guò)表達(dá)在體內(nèi)是否有利于促進(jìn)下肢局部缺血的恢復(fù)。 方法：實(shí)驗(yàn)性下肢缺血的裸鼠造模，術(shù)后7 天觀察造模是否成功；在體外通過(guò)腺病毒感染的方法介導(dǎo)人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC，經(jīng)尾靜脈將Ad-HIF-1α?EPC 注入實(shí)驗(yàn)性下肢缺血的裸鼠；基因及蛋白水平觀察HIF-1α

10、的轉(zhuǎn)入；28 天后大體標(biāo)本觀察缺血下肢的恢復(fù)情況；毛細(xì)血管計(jì)數(shù)；TTC 法觀察缺血面積；局部溫度測(cè)定及下肢多普勒血流測(cè)定。 結(jié)果：裸鼠左下肢股動(dòng)脈部分結(jié)扎切除術(shù)后7 天造成下肢缺血，經(jīng)尾靜脈移植異種Ad-HIF-1α?EPC 至裸鼠鼠缺血下肢后28 天Ad-GFP-EPC 組及Ad-HIF-1α?EPC 組均未發(fā)現(xiàn)下肢自體離斷，Ad-HIF-1α?EPC 組較Ad-GFP-EPC 組下肢壞死降低60％（N=10）。

11、組織學(xué)上可見(jiàn)移植28 d 后Ad-HIF-1α?EPC 較GFP 對(duì)照組進(jìn)一步促進(jìn)體內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)目增加(P<0.05)，缺血面積減小(20±2％ vs. 26±3％,P<0.05); 功能學(xué)上Ad-HIF-1α?EPC 組幗窩局部皮溫回升、局部血流灌注增加。 結(jié)論：在體內(nèi)，Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染后的EPC 能促進(jìn)EPC 在體內(nèi)對(duì)缺血部位修復(fù)的作用，從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、功能學(xué)等方面均證明其可促進(jìn)缺血下肢的局部血管新生，為缺血性疾病

12、的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第四部分，Ad-HIF-1α-EPC 的靶向性作用及其機(jī)理研究。 目的：探討移植細(xì)胞經(jīng)全身循環(huán)后在體內(nèi)的定位；HIF-1α過(guò)表達(dá)對(duì)EPC 的靶向定位的影響及可能的機(jī)理。 方法：實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)細(xì)胞移植后24 h 大體標(biāo)本中Ad-GFP 在裸鼠體內(nèi)的定位；HLA 免疫組化測(cè)定外源性移植細(xì)胞在體內(nèi)的定位； 免疫組化測(cè)定BrdU 標(biāo)記的外源性移植細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增；Real-timePCR

13、 法及ELISA 測(cè)定移植后缺血部位的趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal derived factor, SDF)、CXCR4（SDF 受體）及VEGF 的表達(dá)。 結(jié)果：移植異種Ad-HIF-1α?EPC 至裸鼠缺血下肢24 h 后可見(jiàn)外源性EPC 聚集于缺血部位，HLA 檢測(cè)示人源的移植細(xì)胞定位并參與缺血區(qū)域的毛細(xì)血管新生，Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染后的EPC 增加移植細(xì)胞的成血管性；mRNA 檢測(cè)提示過(guò)表達(dá)HIF-1α基

14、因可上調(diào)其下游的SDF-1、CXCR4 因子(P<0.05)，增加EPC 招募，同時(shí)促VEGF 水平上調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論：在體內(nèi)，移植的GFP-EPC 可聚集于缺血區(qū)域并參與局部血管新生，Ad-HIF-1α感染后的EPC 可進(jìn)一步促進(jìn)缺血下肢的局部血管新生, 這種EPC 數(shù)量的增加可能與SDF、CXCR4 的招募及VEGF的分泌增加有關(guān)。 結(jié)論： 本研究在通過(guò)密度梯度離心法分離得到人外周血單個(gè)核細(xì)胞，

15、在此基礎(chǔ)上定向誘導(dǎo)分化為EPC，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染或腺病毒感染的方法將HIF-1α轉(zhuǎn)入EPC，以期促進(jìn)EPC 的擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)：在體外通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α有效的轉(zhuǎn)入EPC，在體外模擬體內(nèi)的低氧環(huán)境中HIF-1α不改變EPC 作為EC 前體細(xì)胞的特性，促EPC 向EC 分化；同時(shí)HIF-1α促EPC 加速擴(kuò)增、刺激集落形成單位形成、在體外的遷移功能加強(qiáng)。在隨后的動(dòng)物模型中，成功建立了裸鼠下肢缺血模型，在HIF-1α?EPC 經(jīng)尾靜脈移