缺氧通過HIF-1α調(diào)節(jié)P311促進(jìn)小鼠表皮干細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　P311是于1993年首次在晚期胚胎小鼠的腦組織中發(fā)現(xiàn)，P311基因表達(dá)產(chǎn)生約8kDa大小的胞漿蛋白，因其N末端存在PEST結(jié)構(gòu)域，較易被Met-HGF-SF、泛素-蛋白酶及金屬蛋白酶等多條通路降解致其生物半衰期較短。成年人正常組織中并無P311表達(dá)，P311主要存在于神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中，已有研究表明，P311在促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合、腫瘤血管形成、胚胎發(fā)育，維持血壓平衡等方面發(fā)揮著重要

2、作用。然而P311蛋白質(zhì)分子量較小且表達(dá)極不穩(wěn)定，這限制了對(duì)P311結(jié)構(gòu)及功能的深入研究。因而迄今尚不完全明確P311的確切生物學(xué)功能及其轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)機(jī)制，也未能將其歸入到某一特定類型的蛋白質(zhì)家族當(dāng)中。
　　本研究旨在通過在體外條件下模擬缺氧環(huán)境，初步研究缺氧（1％O2濃度）及常氧環(huán)境下野生型及同屬來源P311-/-新生小鼠EpSC在不同時(shí)相點(diǎn)的劃痕遷移速率，以及缺氧環(huán)境下野生型EpSC中HIF-1α與P311之間的相互作用。劃痕

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧早期，同種細(xì)胞缺氧條件下遷移速率較常氧條件下更快;同時(shí)，相同時(shí)相點(diǎn)P311-/-來源EpSC較野生型小鼠EpSC遷移速率更慢;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果提示，缺氧條件下，表皮干細(xì)胞中HIF-1α及P311mRNA水平均明顯升高。同時(shí)，HIF-1α抑制后，P311mRNA表達(dá)水平明顯下降。免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧早期HIF-1α及P311蛋白表水平明顯上升。
　　綜上，缺氧條件下，EpSC中

4、P311表達(dá)增強(qiáng)可能受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)，P311表達(dá)能夠促進(jìn)EpSC的遷移。這為下一步進(jìn)行P311生物學(xué)功能及作用機(jī)理研究提供了新的思路。
　　方法：
　　1.HIF-1α與P311在缺氧促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移中的作用
　　1)表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　乙醚吸入麻醉新生小鼠，頸椎脫臼處死，滅菌后仔細(xì)分離皮膚組織，兩步酶法及Ⅳ型膠原蛋白快速黏附法提取表皮干細(xì)胞，定期換液并觀察細(xì)胞生長情況。
　　2)表

5、皮干細(xì)胞的流式鑒定
　　取首次傳代EpSC，待細(xì)胞生長至70％左右融合時(shí)，用抗小鼠CD71及CD49f雙抗孵育，流式細(xì)胞儀檢測兩種標(biāo)志物CD71（-）/CD49f(+)的細(xì)胞百分比。
　　3)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測缺氧對(duì)表皮干細(xì)胞遷移
　　首次傳代細(xì)胞待生長融合至70％左右時(shí)，絲裂霉素C5μg/mL常溫常氧處理2h抑制其增殖，SPSS隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行:第一部分，檢測野生型常氧組、P311-/-常氧組、野生型缺氧組、P3

6、11-/-缺氧組各組EpSC在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度;第二部分，檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各組在劃痕即刻、12h、24h、48h后劃痕愈合剩余寬度，每組每時(shí)相點(diǎn)設(shè)三個(gè)插件。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，析因設(shè)計(jì)方差分析與單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在EpSC缺氧中HIF-1α對(duì)P311的影響
　　

7、1)免疫印跡檢測EpSC中HIF-1α的表達(dá)情況
　　分別取處于對(duì)數(shù)生長期第1代野生型及P311-/-小鼠EpSC，SPSS法隨機(jī)分組，在缺氧0h、12h、24h、48h后應(yīng)用磷酸化蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用SDS-PAGE法進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測EpSC中HIF-1α蛋白表達(dá)水平，凝膠成像儀下成像，Quantity one凝膠定量軟件分析灰度值，將灰度值與內(nèi)參β-Tublin進(jìn)行比較，結(jié)果以比值表示。各時(shí)相點(diǎn)之間的比較采用單因素

8、方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對(duì)P311mRNA在EpSC中表達(dá)的影響
　　SPSS隨機(jī)分組，野生型缺氧對(duì)照組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組EpSC缺氧處理0、12、24、48h后用TRNzol法提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測P311與HIF-1αmRNA的

9、表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，△循環(huán)閡值(Ct)法處理結(jié)果，2-△△Ct即為mRNA相對(duì)表達(dá)量，總體比較采用析因設(shè)計(jì)及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測HIF-1α對(duì)P311在EpSC中表達(dá)的影響
　　同樣SPSS隨機(jī)分組，光學(xué)顯微鏡檢測野生型缺氧組、野生型缺氧DMSO組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組缺氧處理0、12、24、48h后Ep

10、SC中P311表達(dá)（棕色顆粒為陽性）情況。每張圖片取5個(gè)視野觀察，圖片導(dǎo)入Image ProPlus6.0進(jìn)行分析，結(jié)果用積分吸光光度值表示?？傮w比較采用析因設(shè)計(jì)及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測HIF-1α對(duì)P311轉(zhuǎn)錄激活作用
　　首先對(duì)P311啟動(dòng)子序列利用KOD-plus高保真酶進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，構(gòu)建P311啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒。待HEK-293細(xì)胞

11、生長融合至約90％，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，pGL3/basic-空載缺氧組、pGL3/basic-P311常氧組、pGL3/basic-P311缺氧組、pGL3/basic-P311-HIF-1α抑制劑組在處理即刻、12、24、48h后提取總蛋白并檢測熒光素酶活性。以pGL3/basic-P311常氧組即刻為對(duì)照，總體比較采用析因設(shè)計(jì)及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.P31

12、1及HIF-1α在缺氧促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移中的作用
　　1)表皮干細(xì)胞純化及鑒定
　　所提取表干皮細(xì)胞經(jīng)純化、流式鑒定后發(fā)現(xiàn)CD71(-)/CD49f(+)細(xì)胞占87％左右;倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈鋪路石樣生長，單個(gè)細(xì)胞呈規(guī)則多邊形，細(xì)胞體積較小，核質(zhì)比較大，立體感較強(qiáng)，符合EpSC的特征。
　　2)缺氧條件下P311及HIF-1α對(duì)表皮干細(xì)胞遷移的影響
　　與野生型缺氧組比較，P311-/-EpSC常氧

13、及缺氧、野生型HIF-1α抑制劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯較寬;野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組12、24h劃痕剩余寬度明顯變小，P值均＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7組間48h總體比較無差異，(F=19.02，P＞0.05).
　　2.在EpSC缺氧中HIF-1α對(duì)P311表達(dá)的影響
　　1)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測HIF-1α在EpSC中的表達(dá)
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與常氧條件下相比，缺氧12h后野生型及P311-/-E

14、pSC中HIF-1α表達(dá)至較高水平，24h開始下降，48h與常氧無明顯差異。野生型小鼠表皮干細(xì)胞缺氧0、12、24、48h的HIF-1α蛋白表達(dá)分別為1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03，總體比較差異明顯(F=48.30，P＜0.05)。與缺氧0h比較，缺氧12h后HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，缺氧24h開始下降但仍高于缺氧0h(P＜0.05)，缺氧48h后降至常氧水平(P＞0.

15、05).
　　2)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測HIF-1α對(duì)P311mRNA表達(dá)水平的影響
　　與單純?nèi)毖踅M比較，HIF-1抑制劑組細(xì)胞缺氧各時(shí)相點(diǎn)P311mRNA表達(dá)均明顯下降（P值均小于0.05），HIF-1穩(wěn)定劑細(xì)胞則在缺氧12和24h明顯升高(P值均小于0.05)。與HIF-1抑制劑組比較，DMSO對(duì)照組和HIF-1穩(wěn)定劑細(xì)胞在缺氧0、12、24h P311mRNA表達(dá)均明顯升高（P值均小于0.05）。與單純?nèi)毖踅M比

16、較，HIF-1抑制劑組細(xì)胞缺氧各時(shí)相點(diǎn)P311表達(dá)均明顯下降（P值均小于0.05），而HIF-1穩(wěn)定劑組則在缺氧12和24h明顯升高（P值均小于0.05）。與HIF-1抑制劑組比較，DMSO對(duì)照組和HIF-1穩(wěn)定劑組細(xì)胞P311表達(dá)缺氧12和24h明顯升高（P值均小于0.05）.
　　3)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測P311表達(dá)水平
　　野生型缺氧對(duì)照組、野生型DMSO對(duì)照組、野生型HIF-1α抑制劑組、野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組各

17、組缺氧12h后P311陽性細(xì)胞數(shù)目分別為23.1±1.2、22.5±1.1、6.2±0.8、29.6±1.3;與野生型缺氧對(duì)照組相比，野生型抑制劑組12，24h P311表達(dá)明顯下降，而野生型HIF-1α穩(wěn)定劑組則明顯上升，P值均＜0.05，各組差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
　　3.HIF-1α對(duì)P311的轉(zhuǎn)錄激活作用
　　培養(yǎng)0h，空載缺氧組、P311常氧組、P311缺氧組、P311缺氧+HIF-1抑制劑組細(xì)胞熒光素酶活性差異無