CLC-3調(diào)節(jié)表皮干細胞遷移修復皮膚創(chuàng)面作用的研究.pdf

1、目的：
　　當創(chuàng)傷發(fā)生時，如果組織的完整和內(nèi)部平衡重建，體內(nèi)多種細胞內(nèi)和細胞間的路徑會被激活并相互協(xié)調(diào)(1)。研究發(fā)現(xiàn)表皮干細胞ESCs能夠從表皮或表皮與皮脂腺間毛囊處漏斗管遷移參與表皮修復(1-5)。然而對此創(chuàng)面愈合復雜生理過程的影響因素仍知之甚少。因為缺乏對控制表皮干細胞體積和創(chuàng)傷后遷移運動影響因素的進一步研究，這方面的研究知識很少。
　　有研究報道在腫瘤發(fā)育和侵襲中，膜離子通道在腫瘤細胞增殖、遷移和凋亡中起重要作用(6

2、)。電壓門控性鈉離子通道、鉀離子通道、鈣離子通道在乳腺癌(7)、黑色素瘤(8)、纖維肉瘤(9)的腫瘤侵襲和細胞遷移中起作用。氯離子通道是體內(nèi)最重要的陰離子通道，基于它的門控機制，氯離子通道可以被分成五個亞型，其中之一是容積激活性氯離子通道(VACC)(10)。容積激活性氯離子通道(VACC)對因受滲透性的細胞腫脹刺激產(chǎn)生的容積激活性氯離子電流變化(ICl,vol）負有責任。通過VACC的氯離子和鉀離子外流同鉀離子通道一起導致被稱為調(diào)節(jié)性

3、體積減小(RVD)的細胞體積變小(11，12)。VACC變化已經(jīng)確定在神經(jīng)膠質瘤細胞遷移中起重要作用(13，14)。盡管目前對于主要負責提供容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的通道蛋白仍然不確定，CLC-3，作為電壓門控性氯離子通道CLC家族中的一員，是重要分子候選蛋白之一(15-17)。CLC-3是激活和調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流(ICl,vol)的分子成分(18，19)。在很多腫瘤細胞中它的蛋白表達得到確定，包括前列腺癌上皮細胞(

4、20)、神經(jīng)膠質瘤細胞(21)、PC12細胞(22)和CNE-2Z細胞(23)。大量研究重點放在了氯離子通道的表達及其在細胞遷移和侵襲中發(fā)揮作用上。問題是表皮干細胞上是否有CLC-3氯通道蛋白表達，如果有，CLC-3氯通道蛋白是否通過容積激活性氯離子電流(ICl,vol)或調(diào)節(jié)性體積減小(RVD)來調(diào)節(jié)表皮干細胞的細胞體積變化。創(chuàng)面修復過程中表皮干細胞遷移時CLC-3氯通道蛋白作用也沒有在皮膚切除模型中研究過。因此，我們對表皮干細胞上C

5、LC-3氯通道蛋白表達及容積激活性氯離子通道(VACC)功能作用進行了研究，使用RNA干擾抑制CLC-3氯通道蛋白表達來評估CLC-3氯通道蛋白在表皮干細胞遷移中的作用。
　　本課題主要就表皮干細胞遷移的“內(nèi)在動力”作為切入點，對CLC-3氯通道蛋白在表皮干細胞遷移運動中的作用進行初步研究。我們對表皮干細胞遷移運動中CLC-3氯通道蛋白所起調(diào)節(jié)作用的研究，將有助于尋找介入表皮干細胞遷移的靶點和挖掘有效促進創(chuàng)面愈合治療措施。

6、　　方法：
　　1.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細胞中提取總RNA，并用RT-PCR方法檢測CLC-3氯通道m(xù)RNA在正常大鼠表皮干細胞上的表達。
　　2.Western Blotting方法檢測CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細胞上的表達。
　　3.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細胞上經(jīng)過免疫熒光方法觀察CLC-3氯通道蛋白是否表達。
　　4.免疫熒光方法檢測正常SD大鼠皮膚表皮干細胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白表達

7、情況。免疫熒光雙標染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣表皮干細胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白表達情況。
　　5.CLC-3過表達及抑制表達載體構建、轉染表皮干細胞及對表皮干細胞CLC-3的影響。
　　6.CLC-3過表達及抑制表達載體轉染的表皮干細胞容積敏感性氯電流變化情況。
　　結果：
　　1.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細胞中提取總RNA，并用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)CLC-3氯通道m(xù)RNA在

8、正常大鼠表皮干細胞上表達。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，陰性對照組無條帶，而表皮干細胞在電泳結果上出現(xiàn)一條特異擴增條帶，位置為200bp，表明CLC-3氯通道m(xù)RNA在正常大鼠表皮干細胞上表達。
　　2.Western Blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細胞上表達。檢測到一條分子量為92kDa的CLC-3蛋白在正常大鼠表皮干細胞上的表達。
　　3.在體外培養(yǎng)的正常大鼠表皮干細胞經(jīng)過免疫熒光方法觀察發(fā)現(xiàn)CL

9、C-3氯通道蛋白在正常大鼠表皮干細胞上表達?？梢钥吹桨ぁ麧{有紅色熒光的陽性表達，表明正常大鼠表皮干細胞上有CLC-3氯通道蛋白表達，定位于胞膜、胞漿。
　　4.免疫熒光方法檢測正常SD大鼠皮膚CLC-3氯通道蛋白情況，我們選用一直被研究者公認并采用的標記物β1整合素作為ESCs的陽性篩選標記（綠色熒光），與CLC-3氯通道蛋白共定位，結果顯示可見表皮基底層細胞排列規(guī)則，整齊，表皮基底層細胞體積正常，細胞漿熒光強度弱，胞膜、胞漿

10、有紅色熒光的陽性表達。表明正常大鼠皮膚表皮上有CLC-3氯通道蛋白表達。免疫熒光雙標染色觀察正常大鼠急性皮膚傷切除模型創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)緣表皮干細胞分布情況及CLC-3氯通道蛋白的表達，標記物β1整合素作為ESCs的陽性篩選標記（綠色熒光），與CLC-3氯通道蛋白（紅色熒光）共定位，致傷后1天，我們看到創(chuàng)緣部位表皮層沒有出現(xiàn)明顯的熒光增強現(xiàn)象，表皮層沒有增厚，但能夠在創(chuàng)緣附近表皮層中看到有少量膜熒光較強的細胞。致傷后3天時，創(chuàng)緣胞膜熒光陽

11、性表達細胞明顯增多，創(chuàng)緣表皮層增厚。致傷后7天時，創(chuàng)緣部位表皮基底層細胞形態(tài)仍不規(guī)則，依然處于旺盛的增殖分裂狀態(tài)，創(chuàng)緣胞膜熒光陽性表達細胞熒光略微減弱，創(chuàng)緣部位表皮層厚，細胞數(shù)量多。致傷后10天時，創(chuàng)緣部位表皮基底層細胞排列逐漸緊密，細胞形態(tài)變得規(guī)則整齊，創(chuàng)緣胞膜熒光陽性表達細胞熒光進一步減弱，創(chuàng)緣部位表皮層變薄，細胞數(shù)量減少。
　　5.CLC-3表達及抑制表達載體構建、轉染表皮干細胞及對表皮干細胞CLC-3的影響。熒光顯微鏡鏡下

12、觀察表皮干細胞形態(tài)及感染效率，可以看到感染慢病毒的表皮干細胞生長狀況良好，形態(tài)正常，RNA干擾靶點病毒感染效率均高于90％。Real-time PCR檢測最優(yōu)靶點mRNA的敲除效率基因表達變化分析結果，Western Blot檢測最優(yōu)靶點蛋白水平的敲除效率蛋白表達變化分析結果，轉染CLCN3表達病毒后，CLCN3蛋白水平有所上升。CLCN3sh2和CLCN3sh3都能有效降低CLCN3氯通道蛋白表達水平，而CLCN3sh1和contro

13、l組相比對CLCN3氯通道蛋白表達水平影響沒有顯著差異(P＞0.05)，而CLCN3sh2干擾序列能夠最有效的干擾CLCN3基因的轉錄。CLCN3sh2干擾序列能夠有效的抑制CLCN3蛋白的表達。
　　6.CLC-3過表達及抑制表達載體轉染的表皮干細胞容積敏感性氯電流變化情況。我們應用全細胞膜片鉗技術對表皮干細胞容積敏感性氯電流變化情況進行了檢測，我們對大鼠表皮干細胞等滲狀態(tài)下、Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over e

14、xpression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細胞低滲狀態(tài)下的電壓-電流關系進行了分析，當Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-over expression組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流受低滲外液刺激被激活后，Lv-CLC3-over expression組較Lv-CLC3-NC組、Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細胞不同鉗制電壓的電流值更高，波動更明顯。而Lv-CLC3-sh組低于Lv-CLC3-

15、NC組大鼠表皮干細胞不同鉗制電壓的電流值，波動不明顯。我們對膜電位鉗制于+100mV時的細胞平均電流密度值進行了統(tǒng)計分析，分析發(fā)現(xiàn)，當膜電位鉗制于+100mV時，Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA，Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pA，顯著高于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細胞容積敏感性

16、氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA(P＜0.01)。Lv-CLC3-sh組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為367.43±18.41pA，顯著低于Lv-CLC3-NC組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為722.77±21.57pA和Lv-CLC3-over expression組大鼠表皮干細胞容積敏感性氯電流平均電流密度值為1257.39±41.58pA(P＜0.01)。
　　結論：