ClC-2氯通道在糖尿病難愈性創(chuàng)面表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用和機(jī)制.pdf

1、糖尿病難愈性創(chuàng)面是糖尿病患者除全身系統(tǒng)性疾病外發(fā)生的一種常見的、嚴(yán)重的局部并發(fā)癥。引起糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的原因也是多方面的，局部創(chuàng)面再上皮化進(jìn)程的破壞可導(dǎo)致創(chuàng)面的延遲愈合。很多糖尿病創(chuàng)面經(jīng)傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)處理后并沒有取得良好的療效。細(xì)胞療法是治療糖尿病難愈性創(chuàng)面的一種很有發(fā)展遠(yuǎn)景的治療手段。無論是急性還是慢性創(chuàng)面，實(shí)現(xiàn)再上皮化對創(chuàng)面的封閉和愈合至關(guān)重要。而在急性創(chuàng)面的再上皮化進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色的表皮干細(xì)胞在慢性創(chuàng)面包括糖尿病創(chuàng)面的愈合方面卻

2、沒有發(fā)揮相似的作用。
　　皮膚的自我更新及自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有賴于功能正常的表皮干細(xì)胞的存在。當(dāng)皮膚受到損傷后，干細(xì)胞開始分裂成姐妹細(xì)胞并遷移到創(chuàng)面參與皮膚的再上皮化過程。表皮干細(xì)胞(ESCs)在皮膚發(fā)生急性創(chuàng)傷后在多種因素的作用下向創(chuàng)緣聚集并參與創(chuàng)面的再上皮化修復(fù)。但在糖尿病足創(chuàng)面，上述修復(fù)機(jī)制卻沒有發(fā)揮作用，我們推測可能是糖尿病內(nèi)環(huán)境下，表皮干細(xì)胞向創(chuàng)面遷移的能力被抑制，從而延遲了創(chuàng)面的愈合。
　　容積激活型（或敏感型）氯通道(

3、VACC)是細(xì)胞在滲透性刺激的情況下能激活出容積激活型氯電流(ICl,vol)的一類陰離子通道。在低滲性刺激、細(xì)胞發(fā)生腫脹后，Cl-和K+分別通過VACC和K+離子通道（如BK通道）外流，伴隨著滲透性水分子外流，導(dǎo)致細(xì)胞的容積減小。上述過程稱之為調(diào)節(jié)性容積減少(RVD)。VACC及RVD被證實(shí)參與了細(xì)胞的增殖及遷移功能，而后兩者對于創(chuàng)面的再上皮化進(jìn)程是非常重要的。研究證實(shí)ClC-2氯通道參與了細(xì)胞內(nèi)Cl離子濃度的調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞容積改變

4、及細(xì)胞的遷移。然而，ClC-2氯通道是否參與了表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)并在糖尿病難愈性創(chuàng)面的形成過程中發(fā)揮作用尚不清楚。
　　目的:分析糖尿病高糖狀態(tài)、ClC-2通道及細(xì)胞遷移之間的相關(guān)性，探討ClC-2通道在糖尿病表皮干細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中的作用及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，充實(shí)糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的基礎(chǔ)理論，為指導(dǎo)臨床實(shí)踐打下基礎(chǔ)。
　　方法:糖尿病的高糖狀態(tài)是引起ESCs細(xì)胞功能改變的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，本研究用高糖培養(yǎng)的方法培養(yǎng)用Ⅳ型膠原分離的大鼠表

5、皮干細(xì)胞，檢測并觀察糖尿病狀態(tài)下ClC-2通道的表達(dá)、容積敏感型氯電流及細(xì)胞遷移能力的改變情況;用慢病毒載體將ClC-2 mRNA對應(yīng)的shRNA導(dǎo)入正常表皮干細(xì)胞以模擬糖尿病狀態(tài)下ClC-2通道表達(dá)受抑制的情況，觀察相應(yīng)的細(xì)胞功能如遷移能力和ICl,vol改變的情況;最后從PI3K信號入手，探討糖尿病影響ClC-2表達(dá)和相關(guān)功能改變的機(jī)制。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞免疫熒光法檢測Ⅳ型膠原快速黏附法分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞。細(xì)胞上β1-整合素

6、及K19蛋白表達(dá)均為陽性，說明該法培養(yǎng)所得細(xì)胞為表皮干細(xì)胞;
　　2.免疫細(xì)胞熒光、Real time-PCR和免疫蛋白印跡檢測的ESCs的細(xì)胞ClC-2通道表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ClC-2在細(xì)胞膜上表達(dá)，糖尿病狀態(tài)下ClC-2通道的表達(dá)下降;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測ESCs的容積敏感型氯電流，高糖培養(yǎng)的ESCs容積敏感型氯電流受到抑制;此外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)的ESCs的體外遷移能力下降;
　　3

7、.酶切證實(shí)攜帶shRNA的慢病毒載體構(gòu)建成功，可有效感染ESCs，估計(jì)感染效率達(dá)到90％以上，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;Real time-PCR和免疫蛋白印跡檢測各組ClC-2通道表達(dá)抑制效率后以抑制效率最高的進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);
　　4.慢病毒轉(zhuǎn)染的ESCs的容積敏感型氯電流及細(xì)胞體外遷移能力受到抑制;
　　5.Westem blotting檢測發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的ESCs中PI3K的磷酸化水平下降;
　　6.PI3K抑制

8、劑渥曼青霉素可以抑制ClC-2通道的表達(dá)、細(xì)胞的ICl,vol及遷移運(yùn)動(dòng)。
　　結(jié)論:1.糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞ClC-2通道的表達(dá)下降，同時(shí)細(xì)胞的容積敏感型氯電流及遷移能力受到抑制，這三者之間可能存在相關(guān)性;
　　2.慢病毒介導(dǎo)的ClC-2 mRNA對應(yīng)的shRNA可以有效抑制ClC-2通道的表達(dá)，成功模擬了糖尿病狀態(tài)下ClC-2表達(dá)下降、容積敏感型氯電流及細(xì)胞體外遷移能力受抑制的情況，說明ESCs的ClC-2通道與細(xì)胞IC