容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯通道在大鼠基底動脈平滑肌細胞增殖和細胞周期中的作用.pdf

1、腦動脈重塑是高血壓發(fā)展過程中引起腦卒中重要因素，血管重塑涉及到血管平滑肌細胞增殖、凋亡、炎癥及纖維化等多重復(fù)雜的過程，其中動脈血管平滑肌細胞增生和肥大被認為是動脈血管重塑的最重要特征，其表現(xiàn)為血管平滑肌細胞的數(shù)目增多以及細胞體積的增大。因此研究引發(fā)腦動脈血管平滑肌增殖的機制是研究預(yù)防和治療腦血管病變的一個重要環(huán)節(jié)。 ClC-3氯通道屬于電壓依賴性氯通道家族β亞族，ClC-3Cl-蛋白廣泛分布與腦、腎臟、肺、整個脈管等組織器官。近

2、來ClC-3Cl-蛋白在細胞增殖過程中的作用引起重視，我們實驗室在大鼠主動脈平滑肌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，ET-1能促進ClC-3蛋白的表達，這一作用與其促細胞增殖反應(yīng)呈正相關(guān)性，而ClC-3反義寡核苷酸可呈濃度依賴性抑制ET-1引起的內(nèi)源性ClC-3蛋白表達以及3H-胸腺嘧啶摻入，二者存在相關(guān)性。說明ClC-3通道參與了血管平滑肌細胞增殖過程。ET-1和其他血管活性因子可促進肺動脈平滑肌細胞的ClC-3mRNA的表達，同時ClC-3蛋白能被生

3、長因子上調(diào)也在前列腺癌細胞系以及淋巴細胞上得到證實，在體研究方面我們實驗室在兩腎兩夾的腎性高血壓的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，隨著血壓的增加，基底動脈血管平滑肌細胞容積增大，低滲誘導(dǎo)氯通道開放增強導(dǎo)致細胞內(nèi)氯外流增加，與此同時腦基底動脈平滑肌表達ClC-3蛋白表達增加。ClC-3也被報道參與肺動脈高壓引起的右心室重塑，這些資料說明ClC-3氯通道介導(dǎo)的氯運動參與細胞增殖等容量的變化相關(guān)的病理生理過程。 本課題擬在回答三方面問題：1)ClC-

4、3氯通道是否參與腦基底動脈平滑肌細胞的增殖?2)ClC-3氯通道對細胞周期進程如何影響，是否調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白，以及影響哪些細胞周期相關(guān)的信號通路?如何影響?3)直接激活VRCC對細胞增殖和細胞周期的影響，由哪些信號介導(dǎo)?ClC-3氯通道在VRCC調(diào)節(jié)細胞增殖中的作用。 第一部分ClC-3氯通道蛋白在大鼠腦基底動脈平滑肌細胞增殖中的作用 1.StealthsiRNA對基底動脈血管平滑肌細胞內(nèi)源性及ET-1誘導(dǎo)的ClC-

5、3蛋白表達的作用 Westernblot分析表明大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞上有內(nèi)源性ClC-3氯通道蛋白表達，分子量為80-100kDa。10nmol·L-1ET-1處理48小時后ClC-3蛋白表達增加到比未給ET-1刺激的對照組的2.05±0.21倍。 為了沉默ClC-3蛋白表達，我們設(shè)計了三對StealthsiRNA片斷分別轉(zhuǎn)染入腦基底動脈血管平滑肌細胞。 2.沉默ClC-3蛋白對基底動脈血管平滑肌細胞增殖

6、的影響 用細胞計數(shù)和MTT(WST-8新一代MTT)試驗分析細胞增殖。MTT分析細胞增殖試驗結(jié)果表明：同對照組相比，基底動脈平滑肌細胞MTT的代謝率在ET-1處理組、ET-1+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加1.54±0.17、1.52±0.12、1.51±0.18倍及1.09±1.10倍，siRNA沉默ClC-3蛋白表達后ET-1誘導(dǎo)的細

7、胞數(shù)目增加以及MTT代謝增加分別被抑制。 3.過表達ClC-3蛋白對細胞增殖的影響 將ClC-3全長質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入基底動脈平滑肌細胞可明顯增加ClC-3蛋白表達。轉(zhuǎn)染后細胞增殖實驗表明：iipofectamine對照組、pcDNA3.1質(zhì)粒對照處理組、ET-1+pcDNA3.1質(zhì)粒處理組，ET-1+CIC-3pcDNA處理組中細胞的MTT代謝率分別為空白對照組的0.95±0.07、1.01±0.1、1.45±0.08倍、1

8、.75±0.07倍，表明外源性轉(zhuǎn)染全長ClC-3cDNA后使之過表達后可加快ET-1誘導(dǎo)的基底動脈平滑肌細胞增殖的速度。 小結(jié)： 1)大鼠腦基底動脈平滑肌細胞上有內(nèi)源性ClC-3氯通道蛋白表達，分子量80-100KD，ET-1可誘導(dǎo)ClC-3氯通道蛋白表達。 2)沉默ClC-3氯通道抑制ET-1誘導(dǎo)的基底動脈平滑肌細胞增殖。 3)ClC-3過表達加快ET-1誘導(dǎo)的基底動脈平滑肌細胞增殖。 以上結(jié)果

9、提示ClC-3氯通道可促進基底動脈平滑肌細胞增殖。 第二部分沉默ClC-3對細胞周期的影響以及相關(guān)機制。 1.沉默ClC-3蛋白對基底動脈血管平滑肌細胞周期的影響 流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果顯示：siRNA沉默ClC-3表達后G0/G1期的細胞數(shù)目比例從62.67±2.90％增加到78.87±4.36％，與之對應(yīng)S期的細胞數(shù)目比例從32.68±3.64％下降到17.04±2.17％。 2.沉默ClC-3蛋

10、白對細胞周期調(diào)控蛋白的影響 同空白對照組相比，基底動脈平滑肌細胞cyclinD1的表達在ET-1處理組、ET-1+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加，表明ET-1能明顯增加細胞的cyclinD1的表達，ClC-3被沉默后，ET-1的這個效應(yīng)明顯受到抑制。 同空白對照組相比，基底動脈平滑肌細胞cyclinE表達在ET-1處理組、ET-1

11、+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加，表明ET-1能明顯增加細胞的cyclinE的表達，如果ClC-3被沉默ET-1的這個效應(yīng)受到抑制。 與空白對照組相比，基底動脈平滑肌細胞P21，P27的表達在ET-1處理組分別減少，表明ET-1能明顯抑制P21，P27的表達，沉默ClC-3可以逆轉(zhuǎn)ET-1對這兩個蛋白表達的影響。 3.沉默ClC-

12、3蛋白對細胞周期調(diào)控相關(guān)信號通路的影響 為了進一步分析沉默ClC-3表達后對細胞周期影響的原因，我們檢查與血管平滑肌細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)控相關(guān)的磷酸化信號通路，結(jié)果表明同對照組相比，ET-1能誘導(dǎo)基底動脈平滑肌細胞ERK1/2的磷酸化，10min就有明顯增加，1小時后達到高峰，隨后磷酸化水平下降，12小時后下降到接近基礎(chǔ)水平，當(dāng)ClC-3表達沉默后，ET-1也能誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化但是其程度明顯比未沉默組明顯減弱。

13、小結(jié)： 1)沉默ClC-3氯通道阻止大鼠基底動脈平滑肌細胞周期從G0/G1期進入S期，阻止DNA的合成。說明ClC-3氯通道參與基底動脈平滑肌細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。 2)沉默ClC-3抑制細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和cyclinE表達，增加P21，P27表達。 3)沉默ClC-3抑制ERK1/2的磷酸化，沉默ClC-3抑制Akt308、473位點和GSK3β的ser9位點磷酸化。說明ClC-3通過這些

14、磷酸化信號通路影響細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。 第三部分ClC-3通道在低滲激活VRCC后引起細胞增殖中的作用及機制 1.低滲激活VRCC對細胞增殖和細胞周期的影響及ClC-3蛋白在該過程中的作用 流式細胞儀分析細胞周期發(fā)現(xiàn)基底動脈平滑肌細胞G0/G1期的細胞數(shù)目比例在等滲對照組、低滲培養(yǎng)處理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組處于S期的細胞數(shù)目比例在分別在等滲對照組、低滲培養(yǎng)處

15、理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組分別為11.24±3.92％、30.14±5.48％、31.43±5.12％、12.31±5.09％。siRNA沉默ClC-3表達后G0/G1期的細胞數(shù)目比例從62.61±4.3％增加到78.94±3.91％而與之相反S期的細胞比例從30.14±5.49％下降到12.31±5.09％。進一步通過BrdU試驗觀察ClC-3沉默后對DNA摻入的影響，同等滲對照組相

16、比，基底動脈平滑肌細胞BrdU摻入率在低滲培養(yǎng)處理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組分別增加。 2.低滲對細胞容積的影響以及ClC-3的作用 通過檢測細胞的電容來觀察細胞的容積變化在細胞增殖中的作用，結(jié)果表明：等滲對照組的電容為37.28±1.31pF，低滲處理可使細胞容積增加，膜電容增加到48.56±2.08pF，沉默ClC-3后低滲能誘導(dǎo)細胞電容增加到40.44±2.52pF

17、，但是增加幅度遠較未沉默組小。 3.低滲對增殖相關(guān)信號通路的影響以及ClC-3在這個過程中的作用 為了進一步觀察沉默ClC-3表達的作用，我們檢查與細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換點相關(guān)的信號通路，結(jié)果表明同對照組相比，低滲處理1小時能引起基底動脈平滑肌細胞ERK1/2磷酸化，當(dāng)ClC-3表達被沉默后，低滲誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化程度明顯比未沉默組減弱。 1)低滲直接激活VRCC誘導(dǎo)大鼠基底動脈平滑肌細胞增殖且促進細胞周期從