動(dòng)態(tài)壓力聯(lián)合IGF-1基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化及HIF-1α表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 觀察動(dòng)態(tài)機(jī)械壓力聯(lián)合IGF-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)HIF-1α表達(dá)的影響,并探討HIF-1α促進(jìn)成軟骨分化的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、無菌條件下切取成年新西蘭大耳白兔頸后部皮下脂肪組織,采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,分離、純化、體外擴(kuò)增兔ADSCs。
　　 2、在脂質(zhì)體介導(dǎo)下,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1的細(xì)胞株,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后

2、細(xì)胞中IGF-1的表達(dá)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以5x107/ml的密度接種于殼聚糖/明膠復(fù)合支架材料上,分組培養(yǎng):A組(空白對(duì)照組)接種未轉(zhuǎn)染基因的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,B組(IGF-1組)接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰島素樣生長(zhǎng)因子1的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,C組(壓力組)與D組(壓力+IGF-1組)分別為A、B組的細(xì)胞/支架復(fù)合物于壓力型生物反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)(2％at0.1Hz),每天4小時(shí)(加壓20min-間歇20min,6個(gè)循環(huán)),連續(xù)培養(yǎng)7天。<

3、br>　　 4、觀察各組大體形態(tài),比較彈性模量的差異。
　　 5、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和其在支架材料上的貼附伸展情況。
　　 6、MTT法繪制細(xì)胞/支架復(fù)合物的增殖曲線,并應(yīng)用Dil熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞增殖及分布情況。
　　 7、1,9-二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)法定量測(cè)定糖胺聚糖(GAG)含量。
　　 8、Real time PCR定量檢測(cè)組織工程軟骨中IGF-1,HIF-1α,Ⅱ型膠原(COLⅡ)和Sox

4、-9基因的相對(duì)表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功分離、純化、培養(yǎng)兔ADSCs,貼壁生長(zhǎng)后,原代及傳代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,形態(tài)為長(zhǎng)梭性。
　　 2、成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3-1-IGF-1的細(xì)胞株,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株在mRNA水平上獲得IGF-1的表達(dá)。
　　 3、肉眼見壓力與IGF-1基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合培養(yǎng)組(D組)的細(xì)胞/支架復(fù)合物表面光滑,有光澤,彈性好。彈性模量比較:A組

5、組　　 4、掃描電鏡示各組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,在支架上附著、伸展良好,其中D組細(xì)胞生長(zhǎng)最好,密度較高,形態(tài)飽滿,細(xì)胞成片,可見明顯的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。
　　 5、MTT提示細(xì)胞增殖能力:A組　　 6、GAG含量測(cè)定結(jié)果顯示:A組

6、G含量明顯高于其它各組,P<0.01。
　　 7、Real time PCR結(jié)果提示各組細(xì)胞/支架復(fù)合物中的IGF-1,HIF-1α,Ⅱ型膠原和Sox-9基因的相對(duì)表達(dá)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01。實(shí)驗(yàn)證實(shí)單純基因轉(zhuǎn)染組的HIF-1α、Sox-9等基因表達(dá)水平明顯高于單純壓力組,而二者聯(lián)合培養(yǎng)則能夠獲得更為顯著的效果,其基因表達(dá)量遠(yuǎn)大于二者簡(jiǎn)單加和的結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、IGF-1基因轉(zhuǎn)染能夠有效促進(jìn)

7、兔ADSCs成軟骨細(xì)胞分化,使之可以成為優(yōu)秀的組織工程種子細(xì)胞。
　　 2、殼聚糖/明膠復(fù)合支架材料可以作為兔ADSCs三維立體培養(yǎng)的載體,為其提供粘附生長(zhǎng)、向軟骨細(xì)胞分化、合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的場(chǎng)所。
　　 3、IGF-1基因轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)兔ADSCs HIF-1α的表達(dá)水平。
　　 4、周期性動(dòng)態(tài)壓力增加HIF-1α表達(dá),同時(shí)刺激細(xì)胞自身分泌力敏感因子--IGF-1,從而上調(diào)軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),促