h IGF-1基因轉(zhuǎn)染人臍血間充質(zhì)于細胞的實驗研究.pdf

1、目的:體外研究hIGF-1基因轉(zhuǎn)染人臍帶血間充質(zhì)干細胞的實驗學方法，檢測并觀察基因轉(zhuǎn)染后臍帶血間充質(zhì)干細胞(hUCB-MSCs)的生物學變化。
　　 方法:利用密度梯度離心法與細胞貼壁法相結(jié)合分離培養(yǎng)hUCB-MSCs，流式細胞儀檢測細胞表面抗原標記。構(gòu)建真核表達質(zhì)粒并以X-tremen HP介導(dǎo)將含hIGF-1基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達，

2、酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測轉(zhuǎn)染后不同時間段細胞上清液中hIGF-1的濃度，免疫熒光與RT-PCR檢測hIGF-1在細胞中的表達，免疫組化染色檢測Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)果:密度梯度離心法與細胞貼壁法相結(jié)合可獲得純度較高的hUCB-MSCs，流式細胞儀細胞表面抗原標志CD90、CD105、CD146表達陽性，CD34、CD45、Anti-HLA-DR表達陰性。經(jīng)X-tremen HP介導(dǎo)hIGF-1目的基因可導(dǎo)入UCB-MSCs其轉(zhuǎn)染效

3、率為(28.63±7.59)％，免疫熒光和RT-PCR鑒定均檢測到hIGF-1的表達。轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形，以后逐漸變?yōu)槎嘟切巍LISA檢測hIGF-Ⅰ蛋白質(zhì)分泌在48h達到高峰(34.68±1.4ng/ml)，與對照組相比，具有顯著性差異(p＜0.01)。細胞免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細胞Ⅱ型膠原表達陽性。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達載體pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ，密度梯度離心法與細胞貼壁法