肺炎衣原體感染通過激活Rac1誘導血管平滑肌細胞遷移.pdf

1、目的：
　　 利用肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，C.pn）體外感染大鼠原代血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，觀察Rae1活化在C.pn感染誘導VSMC遷移中的作用以及在此過程中Rac1活化與PI3K、IQGAP1的聯(lián)系，探討其相關分子機制。
　　 方法：
　　 1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠原代VSMC;
　　 2.GST

2、pull-down實驗檢測C.pn感染VSMC后不同時間點Rac1的活性;
　　 3.用Rac1特異性抑制劑NSC23766抑制Rac1的活性，GST pull-down實驗檢測VSMC內GTP-Rac1的表達變化，Wound-healing實驗和Transwell實驗觀察VSMC遷移能力的改變;
　　 4.用PI3K特異性抑制劑LY294002抑制PI3K的活性，GST pull-down實驗檢測VSMC內Rac1活性

3、的變化，明確PI3K在C.pn感染誘導VSMC內Rac1活化過程中的作用;
　　 5.用Rac1特異性抑制劑NSC23766抑制Rac1的活性，Western blot實驗檢測VSMC內IQGAP1表達的變化，明確C.pn感染后VSMC內Rac1活化對其下游效應蛋白IQGAP1的影響。
　　 結果：
　　 1.目的質粒轉染大腸桿菌，體外制備足量有效與GTP-Rac1特異結合的GST-PBD融合蛋白;分別于C.pn

4、感染VSMC0 h、0.5 h、1h、2h、3h、6h、8h和12h后提取總蛋白，GST pull-down實驗結果顯示，C.pn感染VSMC0.5 h后GTP-Rac1表達水平開始升高;隨著感染時間延長其表達水平逐漸升高，3h左右達高峰，8h開始下降，并持續(xù)至12 h;而各時間點VSMC中總Rac1表達水平無顯著差異。
　　 2.GST pull-down實驗結果顯示，使用Rac1特異性抑制劑NSC23766預處理VSMC后，

5、C.pn感染誘導的VSMC內GTP-Rac1的表達水平明顯降低。用NSC23766預處理的C.pn感染組的VSMC內GTP-Rac1的表達水平較單純 C.pn感染組明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義;各組VSMC中總Rac1表達無顯著差異。
　　 3.Wound-healing實驗結果顯示，NSC23766預處理的C.pn感染組VSMC向劃痕中央遷移的面積明顯小于單純C.pn感染組(P＜0.05); Transwell實

6、驗結果顯示，NSC23766預處理的C.pn感染組VSMC的穿膜細胞數(shù)明顯低于單純C.pn感染組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 4.使用PI3K抑制劑LY294002預處理VSMC，GST pull-down實驗結果顯示，LY294002預處理的C.pn感染組VSMC內GTP-Rac1的表達水平較單純C.pn感染組明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義;各組VSMC中總Rac1表達無顯著差異。
　　 5.

7、使用Rac1特異性抑制劑NSC23766預處理VSMC，Western blot實驗結果顯示，50μM NSC23766預處理的C.pn感染組VSMC內IQGAP1的表達水平雖較單純C.pn感染組有所下降(P＞0.05)，但差異無統(tǒng)計學意義;100μMNSC23766預處理的C.pn感染組VSMC內IQGAP1的表達水平較單純C.pn感染組則明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 C.pn感染可