Gen通過(guò)p38通路影響Ra-FLS遷移及侵襲的研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以滑膜炎為其基本病理改變的慢性全身性自身免疫性疾病。位于RA患者滑膜襯里層的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLS)具有類似于腫瘤細(xì)胞的與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附、遷移和侵襲的特征，在RA的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。
　　課題組先前的研究顯示金雀異黃素(Gen)能夠抑制CIA大鼠FLS的增殖，抑制炎癥因子(TNF-α、IL-1β)的分泌，并有控制CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥、抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)破壞的作用。且相關(guān)文

2、獻(xiàn)報(bào)道顯示Gen可以抑制腫瘤細(xì)胞與ECM黏附及遷移、侵襲。故本實(shí)驗(yàn)旨在探究Gen對(duì)RA-FLS與ECM的黏附、遷移和侵襲的影響及其可能存在的機(jī)制。
　　方法:
　　1、以人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞株(MH7A)作為研究對(duì)象，應(yīng)用CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)研究不同濃度Gen對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力的影響，選取對(duì)RA-FLS細(xì)胞活力無(wú)明顯影響的濃度進(jìn)行研究。
　　2、通過(guò)RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、Fi

3、bronectin、Matrigel)的黏附，研究Gen對(duì)RA-FLS與ECM黏附的影響。
　　3、通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究Gen對(duì)RA-FLS遷移的影響;
　　4、通過(guò)transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究Gen對(duì)RA-FLS侵襲的影響。
　　5、通過(guò)羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)RA-FLS的F-actin細(xì)胞骨架系統(tǒng)進(jìn)行染色，觀察Gen對(duì)RA-FLS肌動(dòng)蛋白纖維的分布、絲狀和片狀偽足形成的影響。<

4、br>　　6、應(yīng)用Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白及MMP-2的表達(dá)水平以探究其中可能存在的機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1、細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Gen在20μM、40μM、60μM組測(cè)得的細(xì)胞活力相較于空白對(duì)照組分別為98.30±2.90％、95.70±5.65％和92.70±7.01％，對(duì)RA-FLS的細(xì)胞活力均無(wú)明顯影響，故選取20μM、40μM、60μM濃度的Gen進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　2、與ECM

5、類似物的黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RA-FLS在20μM、40μM、60μM組與CollagenⅠ的黏附率分別為97.43±1.18％、88.92±4.23％及78.25±4.90％，與Fibronectin的黏附率分別為95.18±2.00％、89.35±2.35％、78.43±3.27％，與Matrigel的黏附率分別為96.35±2.13％、84.96±3.21％、75.82±1.38％;Gen在40μM、60μM對(duì)RA-F

6、LS與CollagenⅠ、Fibronectin、Matrigel的黏附均有明顯的抑制作用，且在60μM時(shí)均較40μM時(shí)明顯，而20μM時(shí)對(duì)其黏附無(wú)明顯影響。
　　3、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gen在20μM、40μM、60μM均可以抑制傷痕的愈合，且隨著濃度的增加抑制作用越強(qiáng);在transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，RA-FLS在20μM、40μM、60μM的遷移率相較于空白對(duì)照組分別為97.10±5.16％、77.97±5.44％及

7、51.95±5.26％;40μM、60μM的Gen對(duì)RA-FLS的遷移均有明顯的抑制作用，且60μM時(shí)更為明顯，但20μM時(shí)對(duì)其遷移無(wú)明顯影響。
　　4、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RA-FLS在20μM、40μM、60μM的細(xì)胞侵襲數(shù)目相較于空白對(duì)照組分別為94.79±5.24％、64.54±10.13％及51.32±12.36％;40μM、60μM對(duì)RA-FLS的侵襲均有明顯的抑制作用，且60μM更為明顯，而20μ

8、M對(duì)其侵襲無(wú)明顯影響。
　　5、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示Gen能夠使RA-FLS肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，使張力纖維數(shù)目增多，片狀偽足和絲狀偽足的數(shù)量減少，且隨著濃度的增加這種作用越強(qiáng)，在60μM濃度最明顯。
　　6、Western blot的結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比Gen在20μM、40μM、60μM對(duì)RA-FLS中p-JNK、JNK、p-ERK、ERK水平無(wú)明顯影響; Gen在20μM濃度對(duì)RA-FLS的p-p38水平無(wú)

9、明顯影響，但在40μM、60μM濃度可以下調(diào)RA-FLS±中p-p38水平，而這些濃度對(duì)細(xì)胞中的p38水平則無(wú)明顯影響;并且Gen在這些濃度對(duì)RA-FLS中MMP-2的表達(dá)水平亦無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1、Gen在40μM、60μM濃度時(shí)可以抑制RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、Fibronectin、Matrigel)的黏附、遷移和侵襲，在20μM濃度時(shí)對(duì)RA-FLS與ECM類似物(CollagenⅠ、