FANCF基因沉默通過(guò)激活JNK和p38通路增加了乳腺癌細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的敏感性.pdf

1、前言：
　　 乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命和生活質(zhì)量的惡性腫瘤,化療藥物由于可以延長(zhǎng)患者生存期及改善預(yù)后,其臨床療效受到認(rèn)可,但治療過(guò)程中出現(xiàn)的腫瘤耐藥性或腫瘤復(fù)發(fā)限制了化療藥物的臨床應(yīng)用,受到廣泛研究和關(guān)注。
　　 范可尼貧血蛋白(FA)作為FA/BRCA通路的重要組分,參與細(xì)胞增殖、周期、凋亡和侵襲力等生長(zhǎng)表型以及基因轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性等生命信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控,影響腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑的敏感性。其中FANCF作為銜接蛋白,是

2、穩(wěn)定FA復(fù)合體及FA/BRCA通路生物學(xué)功能的關(guān)鍵因子。在卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),FANCF基因啟動(dòng)子甲基化或者siRNA引起的FANCF蛋白低表達(dá)會(huì)引起FANCD2泛素化失活、FA/BRCA通路功能缺失從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑等抗腫瘤藥物的敏感性,但相關(guān)研究在乳腺癌中未見報(bào)道。
　　 故本研究通過(guò)FANCF基因沉默干預(yù)FA/BRCA通路功能,檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為及對(duì)藥物敏感性變化,并探討可

3、能機(jī)制。旨在研究并發(fā)現(xiàn)能夠有效增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的有效因子或手段,為逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥性、提高臨床治療效果,提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 乳腺癌MCF-7和T-47D細(xì)胞中脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染FANCF-shRNA/control-shRNA:MTT法、AnnexinV/PI雙染法、彗星實(shí)驗(yàn)、JC-1染色法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷及線粒體膜電位的變化;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MX蓄積量變化;并用We

4、sternblot檢測(cè)FANCF、FANCD2、BCRP/LRP/P-gp/MRP等多藥耐藥蛋白、p53、MAPK通路及凋亡通路上相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.乳腺癌MCF-7和T-47D細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FANCFshRNA和controlshRNA不同時(shí)間點(diǎn)(24h和48h)后,和controlshRNA組相比,轉(zhuǎn)染FANCFshRNA24h和48h后兩株細(xì)胞中FANCF蛋白表達(dá)及FANCD2泛素化水平均明

5、顯降低,且在轉(zhuǎn)染48h后降低更明顯。在生物學(xué)特性方面,和controlshRNA組相比,轉(zhuǎn)染FANCFshRNA24h和48h后兩株細(xì)胞中細(xì)胞增殖受抑、凋亡及DNA損傷均增加,其中在轉(zhuǎn)染48h后增加更明顯;并且在p53突變型的T-47D細(xì)胞增加更明顯(P＜0.05),這可能與p53突變的T-47D細(xì)胞DNA穩(wěn)定作用差,加之FANCF沉默后導(dǎo)致FA/BRCA通路活化受抑進(jìn)而使進(jìn)一步加重DNA不穩(wěn)定性相關(guān)。
　　 2.FANCF沉默

6、的乳腺癌MCF-7和T-47D細(xì)胞經(jīng)10μM米托葸醌(MX)處理24h后,與controlshRNA+MX組相比,兩株細(xì)胞內(nèi)MX蓄積量均明顯增加,而且MCF-7細(xì)胞中增加更明顯。對(duì)多藥耐藥蛋白BCRP/MRP/P-gp等的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),BCRP在尼FANCFshRNA+MX組中較MX組表達(dá)降低;其中在p53野生型的MCF-7細(xì)胞中降低更明顯(P＜0.05),MRP、P-gP、LRP表達(dá)未見變化。即說(shuō)明FANCF沉默后MCF-7細(xì)胞對(duì)MX敏感

7、性增加更明顯。
　　 3.MCF-7和T-47D細(xì)胞中FANCF沉默后未見MAPK通路的JNK、ERK、p38蛋白表達(dá)發(fā)生變化,但是在10μM的MX作用下,FANCF沉默可以使MCF-7和T-47D細(xì)胞中INK和p38蛋白表達(dá)及磷酸化水平增加,且明顯高于MX單獨(dú)對(duì)JNK和p38蛋白表達(dá)的增加作用,ERK蛋白表達(dá)無(wú)變化。P38抑制劑和JNK抑制劑預(yù)處理MCF-7和T-47D細(xì)胞發(fā)現(xiàn),p38抑制劑預(yù)處理可使BCRP表達(dá)恢復(fù),JNK抑

8、制劑預(yù)處理對(duì)BCRP表達(dá)未見影響。
　　 4.MX可增加FANCF沉默的p53野生型MCF-7乳腺癌細(xì)胞中p53磷酸化水平,而在p53變異型T-47D乳腺癌細(xì)胞則增加不明顯,說(shuō)明FANCF沉默后p53被激活,但對(duì)p53變異型T-47D乳腺癌細(xì)胞作用較弱;用JNK抑制劑SP600125預(yù)處理后,p53表達(dá)被完全抑制;用p38抑制劑SB203580預(yù)處理后,p53表達(dá)被部分抑制。
　　 5.MX可使FANCF沉默后的乳腺癌M

9、CF-7和T-47D細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)下降,而且在MCF-7細(xì)胞中下降明顯;同時(shí)發(fā)現(xiàn),MX作用于FANCF沉默的MCF-7和T47D細(xì)胞質(zhì)中cyt-c表達(dá)明顯增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)caspase-9活化及PARP剪切,MCF7-細(xì)胞中caspase-6(因?yàn)閏aspase-3在MCF7細(xì)胞中表達(dá)缺失,所以用caspase-6代替[38])和T-47D細(xì)胞中caspase-3活化,并且在p53野生型MCF-7乳腺癌細(xì)胞中較明顯,且發(fā)現(xiàn)兩

10、株細(xì)胞中caspase-8均無(wú)變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.FANCFshRNA可使乳腺癌MCF-7和T-47D細(xì)胞中FANCF沉默,通過(guò)增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及DNA損傷等途徑發(fā)揮阻滯FA/BRCA通路的作用。
　　 2.FANCF沉默誘導(dǎo)MX激活乳腺癌MCF-7和T-47D細(xì)胞中MAPK通路的JNK和p38途徑;其中p38途徑激活選擇性抑制了BCRP表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞耐藥;INK途徑激活對(duì)BCRP表達(dá)沒(méi)有調(diào)控作