p38通路在液壓沖擊傷性腦水腫AQP4表達(dá)變化中作用.pdf

1、第一部分:大鼠液壓沖擊傷性腦水腫p38MAPK表達(dá)規(guī)律及其與AQP4表達(dá)變化的關(guān)系
　　 目的:觀察大鼠液壓沖擊傷性腦水腫p38MAPK表達(dá)規(guī)律及其與AQP4表達(dá)變化的關(guān)系。
　　 方法:雄性SD大鼠56只,體重250～300g,隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組)和外傷組(TBI組),其中TBI組又按傷后1h,6h,12h,24h,3d,7d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為6個(gè)亞組,每組8只。TBI組動(dòng)物常規(guī)麻醉開顱,制作液壓沖擊傷動(dòng)物模型;NC組

2、只行顱骨開窗但不給予液壓打擊。
　　 NC組于術(shù)后,TBI組于術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后,再均以10％水合氯醛過度麻醉,斷頭處死,開顱取腦,經(jīng)損傷區(qū)切成3mm厚冠狀腦片,HE染色行組織形學(xué)觀察,免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。從損傷區(qū)前緣取100mg左右腦組織應(yīng)用干濕重法測(cè)腦組織含水量。損傷區(qū)后緣腦組織矢狀分為2部分,其中一份用Western Blot檢測(cè)AQP4,p38MAPK和p-

3、p38MAPK含量。另一份用RT-PCR檢測(cè)AQP4mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.神經(jīng)功能評(píng)分:TBI組與NC組比較,在傷后6h評(píng)分開始減低(2.875±1.126,P＜0.05);12h(4.375±0.916)較6h有所升高,但仍低于NC組(P＜0.05);24h時(shí)評(píng)分又出現(xiàn)降低(2.125±0.835,P＜0.05);之后評(píng)分逐漸升高,3d神經(jīng)功能評(píng)分(5.75±0.886,P＜0.05)仍低于NC組。

4、
　　 2.組織學(xué)觀察:TBI組動(dòng)物動(dòng)物傷后6h開始出現(xiàn)細(xì)胞水腫,12h細(xì)胞水腫較前加重,24h時(shí)水腫最為明顯,可見細(xì)胞體積明顯增大,胞漿淡染,甚至出現(xiàn)空泡變性,并伴有膠質(zhì)細(xì)胞的增生,3d時(shí)水腫程度有所減輕,7d時(shí)明顯減退,但膠質(zhì)細(xì)胞增生逐漸顯著。
　　 3.大鼠腦含水量
　　 TBI組與NC組相比,1h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),6h時(shí)稍升高(79.54±0.715,P＜0.05),12h明顯升高(81

5、.89±0.581,P＜0.05),24h達(dá)到高峰(83.31±1.115,P＜0.05),3d開始下降(82.13±0.593,P＜0.05),7天明顯下降(81.24±1.010,P＜0.05)。
　　 4.免疫組化
　　 AQP4主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞胞膜表達(dá),尤其豐富表達(dá)于與毛細(xì)血管和軟腦摸直接接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上。TBI組動(dòng)物水腫腦組織AQP4于傷后6h(0.424±0.021,P＜0.05)開始增

6、高,24h(0.909±0.052,P＜0.05)達(dá)到高峰,隨后逐漸降低。p38MAPK在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá),尤其在腦室兩側(cè)和脈絡(luò)叢表達(dá)明顯,在液壓沖擊腦損傷后隨著時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸增強(qiáng),12h(0.400±0.034,P＜0.05),24h(0.585±0.026,P＜0.05),3天(0.746±0.040,P＜0.05),7天(0.917±0.040,P＜0.05)。P-p38MAPK則主要表達(dá)于細(xì)胞核,在正常腦組織中幾

7、乎不表達(dá),液壓沖擊腦損傷后其表達(dá)升高,且變化趨勢(shì)與AQP4變化趨勢(shì)相似,6-12h(0.292±0.022,0.499±0.019,P＜0.05)逐漸升高,24h(0.911±0.049,P＜0.05)達(dá)高峰,3天后出現(xiàn)下降(0.666±0.037,P＜0.05)。
　　 5. Western Blot.
　　 TBI組與NC組相比,TBI組動(dòng)物水腫腦組織AQP4蛋白表達(dá)從6h開始增高(1.639±0.161,P＜0.0

8、5),12h(2.303±0.211,P＜0.05),24h達(dá)到高峰(2.822±0.150,P＜0.05),3d時(shí)降低(2.112±0.195,P＜0.05),7d后明顯降低(1.554±0.199),但仍高于正常(P＜0.05)。
　　 與NC組相比,TBI組動(dòng)物水腫腦組織P-p38MAPK表達(dá)于6h開始逐漸增高(1.581±0.146),24h達(dá)到高峰(2.178±0.124,P＜0.05),3d時(shí)降低(1.913±0.1

9、61,P＜0.05),7d后明顯降低(1.673±0.100),但仍高于正常(P＜0.05)。
　　 與NC組相比,TBI組動(dòng)物水腫腦組織p38MAPK表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸升高,6h(1.417±0.123),12h(1.755±0.079,P＜0.05),24h(2.082±0.106,P＜0.05),3d(2.211±0.107,P＜0.05),7d(2.373±0.064,P＜0.05)
　　 6. RT-PC

10、R
　　 TBI組動(dòng)物水腫腦組織AQP4mRNA的表達(dá)從1h(0.186±0.016)開始增高,6h為(0.422±0.039,P＜0.05),12h繼續(xù)升高(0.620±0.068,P＜0.05),24h至3d達(dá)到高峰(1.060±0.140,0.739±0.109,P＜0.05),7d后降低(0.429±0.088),仍高于對(duì)照組(P＜0.05)。各亞組間比較均有差異(P＜0.05)。
　　 6腦含水量與AQP4mR

11、NA、AQP4蛋白和p-p38MAPK表達(dá)相關(guān)性分析
　　 TBI組大鼠腦含水量隨AQP4及其mRNA表達(dá)的升高而增加,腦含水量與AQP4蛋白及其mRNA之間呈明顯正相關(guān)(rwestem blot=0.904,r免疫組化=0.935;rm=0.924.,P＜0.01)。
　　 TBI組大鼠腦含水量隨P-p38MAPK表達(dá)增加而增加,腦含水量與p-p38MAPK之間呈明顯正相關(guān)(r免疫組化=0.949,rwestem bl

12、or=0.969,P＜0.01)。
　　 AQP4表達(dá)隨p-p38MAPK表達(dá)增加而增加,p-p38MAPK與AQP4蛋白及其mRNA表達(dá)變化之間都呈明顯正相關(guān)(r免疫組化=0.978;rwesternblot=0.943,P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.大鼠液壓沖擊傷性腦水腫AQP4及其mRNA表達(dá)呈升高趨勢(shì)。
　　 2.大鼠液壓沖擊傷激活p38MAPK通路,p-p38MAPK表達(dá)呈增高趨勢(shì)。

13、
　　 3.大鼠液壓沖擊傷P-p38MAPK表達(dá)與AQP4,AQP4mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 4.液壓沖擊傷后調(diào)控p38MAPK通路可能是治療腦水腫的一種新思路。
　　 第二部分:p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)大鼠中度液壓沖擊傷性腦水腫AQP4表達(dá)變化的影響
　　 目的:觀察p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)液壓沖擊傷水腫腦組織AQP4表達(dá)變化的影響。
　　 方法:雄性

14、SD大鼠152只,體重250～300g,隨機(jī)分為4組:NC組、單純損傷組(TBⅠ組)、SBⅠ組和SBⅡ組。后三組再根據(jù)傷后1h,6h,12h,24h,3d,7d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為6個(gè)亞組,每個(gè)亞組8只大鼠。SBI組和SBⅡ組分別于術(shù)后制作模型前30分鐘,在立體定向儀介導(dǎo)下向右側(cè)腦室內(nèi)注入SB20358010μl,濃度分別為100μmol/L和10μmmol/L。
　　 NC組不進(jìn)行液壓打擊,僅開顱取腦;TBⅠ組、SBⅠ組和SBⅡ組進(jìn)

15、行液壓沖擊損傷,并分別于術(shù)后第1h、6h、12h、24h、3d和7d于各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分,再均以10%水合氯醛過度麻醉,斷頭處死,開顱取腦,經(jīng)損傷區(qū)切成3mm厚冠狀腦片,HE染色行組織形學(xué)觀察,免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。從損傷區(qū)前緣取100mg左右腦組織應(yīng)用干濕重法測(cè)腦組織含水量。損傷區(qū)后緣腦組織矢狀分為2部分,其中一份用Western Blot檢測(cè)AQP4,p38MAPK和p-p3

16、8MAPK含量。另一份用RT-PCR檢測(cè)AQP4mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.神經(jīng)功能評(píng)分
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組神經(jīng)功能評(píng)分各時(shí)間點(diǎn)均有所增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組組間比較,僅于12h(4.875±0.835,5.125±0.835)、24h(2.500±0.926,2.75±0.707)、3d(6.125±0.99,6.38±0.744)差別有統(tǒng)計(jì)

17、學(xué)意義(P＜0.05)。與NC組相比,TBⅠ組,SBⅠ組和SBⅡ組除7天(9.000±0.00,8.375±0.744,8.500±0.535,8.625±0.518)外差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.組織學(xué)觀察
　　 SBⅠ組和SBⅡ組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與TBⅠ組比較,腦組織水腫程度有所減輕,范圍有所減小,炎細(xì)胞滲出減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生減弱,神經(jīng)元周圍間隙縮小。SBⅡ組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞水腫均輕于SBⅠ組。
　

18、　 3.大鼠腦含水量
　　 與TBⅠ組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較,SBⅠ組和SBⅡ組1h均稍低于TBⅠ組(P＞0.05);6h時(shí)明顯低于TBⅠ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),SBⅠ組和SBⅡ組間無差別(P＞0.05),12h時(shí)三組間比較均有差異(P＜0.05),腦水含量分別為(81.89±0.58,80.77±0.79,79.48±0.76),24h時(shí)腦水含量均達(dá)最高,且三組間比較均有差異(P＜0.05),腦水含量分別為(83.

19、31±1.11,82.12±0.90,80.92±0.94),3d開始下降,三組間比較同樣有差異(82.13±0.59,81.12±0.93,79.94±0.99,P＜0.05),7d時(shí)明顯降低(81.24±1.01,80.35±0.58,78.94±0.67),SBⅠ組、SBⅡ組仍稍高于TBⅠ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但SBⅠ組與SBⅡ組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.免疫組化
　　

20、 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組AQe4蛋白表達(dá)在1h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),余各時(shí)間點(diǎn)均低于TBⅠ組,以12h(0.535±0.027,0.489±0.333,0.583±0.016)、24h(0.856±0.023,0.800±0.038,0.909±0.052)、3d(0.776±+0.025,0.708±0.018,0.804±0.016)最為明顯(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組兩組間比較于12h、24h、3

21、d差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 各組P-p38MAPK表達(dá)變化趨勢(shì)與AQP4變化趨勢(shì)相似,傷后6h開始增高,24h達(dá)到高峰,隨后逐漸降低。但與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組P-p38MAPK表達(dá)于6h(0.265±0.024,0.261±0.020,0.292±0.022)、12h(0.426±0.028,0.350±0.026,0.499±0.019)、24h(0.747±0.044,0.665±0.026,0.

22、911±0.049)、3d(0.580±0.042,0.483±0.039,0.666±0.037)、7d(0.342±0.021,0.256±0.018,0.378±0.026)均低于TBⅠ組,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SBⅠ組和SBⅡ組兩組間比較,僅于12h、24h、3d差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組p38MAPK表達(dá)除1h外,余各時(shí)間點(diǎn)均低于TBⅠ組(P＜0.05)。

23、SBⅠ組和SBⅡ組組間相比,SBⅡ組與SBⅠ組除1h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外,在其余各時(shí)間點(diǎn)SBⅡ組p38MAPK表達(dá)都低于SBⅠ組(P＜0.05)。
　　 5. Western Blot
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組和SBⅡ組AQP4蛋白表達(dá)1h差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),其他時(shí)間點(diǎn)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但SBⅠ組與SBⅡ組間組間比較,于12h、24h、3d差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

24、5)。P-p38MAPK表達(dá)與AQP4表達(dá)一致。
　　 p38MAPK表達(dá)1h三組間無差異,TBⅠ組與SBⅠ組比較6h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但TBⅠ組與SBⅡ組、SBⅡ組與SBⅠ組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其余各時(shí)間點(diǎn)三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6. RT-PCR
　　 與TBⅠ組相比,SBⅠ組、SBⅡ組AQP41h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),7d時(shí)SBⅡ組與T