S100A8-S100A9通過(guò)p38MAPK通路調(diào)控EMT促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移.pdf

1、目的:探討在細(xì)胞中外源性添加S100A8/S100A9的培養(yǎng)條件下,S100A8、S100A9是否通過(guò)p38MAPK細(xì)胞通路調(diào)控EMT,從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移。
　　方法:
　　1、分別在CNE1、CNE2和6-10B三種鼻咽癌細(xì)胞系中添加0、0.25、0.5、1、3、5μg/ml S100A8/S100A9蛋白,培養(yǎng)24h后CCK8法檢測(cè)不同濃度的蛋白對(duì)各個(gè)細(xì)胞系增殖能力的影響;添加1μg/ml S100A8/S100

2、A9蛋白通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1和CNE2細(xì)胞克隆形成能力的變化。
　　2、培養(yǎng)基含1μg/ml S100A8/S100A9的實(shí)驗(yàn)組與無(wú)添加的對(duì)照組,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和黏附實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)CNE2細(xì)胞侵襲遷移情況,并利用Transwell實(shí)驗(yàn)比較三株鼻咽癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的侵襲遷移能力。
　　3、培養(yǎng)基添加1μg/ml S100A8/S100A9蛋白,培養(yǎng)CNE1、CNE2和6-10B細(xì)胞,分別在0、0.5、1、3、6、12h

3、六個(gè)時(shí)間段收取細(xì)胞總蛋白,Westernblot檢測(cè)p38MAPK、JNK MAPK、ERK MAPK、NF-KB和Wnt/β-catenin通路各節(jié)點(diǎn)蛋白的累積變化;同時(shí)檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)關(guān)鍵標(biāo)志物E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)。
　　4、下室添加1μg/ml S100A8/S100A9蛋白作為趨化條件,Transwell實(shí)驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組（p38 MAPK通路抑制劑SB230580預(yù)處理鼻咽癌細(xì)胞）和

4、對(duì)照組（SB230580稀釋劑DMSO預(yù)處理的鼻咽癌細(xì)胞）的侵襲遷移能力影響;并運(yùn)用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EMT關(guān)鍵蛋白E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)變化;qRT-PCR檢測(cè)侵襲遷移關(guān)鍵標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、在0.25、0.5、1、3、5μg/ml的S100A8/S100A9蛋白作用下,24h后CCK8法檢測(cè)CNE1、CN

5、E2和6-10B細(xì)胞增殖情況,三株細(xì)胞均表現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì);并且平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示,添加1μg/ml S100A8/S100A9蛋白的實(shí)驗(yàn)組克隆形成能力高于未添加的對(duì)照組。
　　2、培養(yǎng)基添加1μg/ml S100A8/S100A9蛋白的實(shí)驗(yàn)組在劃痕后6h、24h、36h、48h,CNE2細(xì)胞遷移面積大于對(duì)照組;同樣,在包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)CNE2細(xì)胞1h,黏附在基質(zhì)上的細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組; Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)直接

6、顯示1μg/ml S100A8/S100A9蛋白促進(jìn)CNE1、CNE2和6-10B細(xì)胞侵襲遷移。
　　3、Western blot檢測(cè)1μg/ml S100A8/S100A9蛋白對(duì)p38MAPK、JNKMAPK、ERK MAPK、NF-KB和Wnt/β-catenin通路的影響,結(jié)果顯示,p38MAPK和Wnt/β-catenin通路有激活現(xiàn)象,p-p38蛋白和β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)累積增加。CNE1細(xì)胞p-p38蛋白累積

7、在0.5h開(kāi)始上調(diào),到6h達(dá)到峰值;β-catenin蛋白在1h上調(diào)最為明顯。CNE2和6-10B細(xì)胞p-p38蛋白都是在1h上調(diào)最為顯著。Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白表達(dá),三株細(xì)胞均出現(xiàn)E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào);而N-cadherin蛋白均出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象。
　　4、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,SB230580抑制p38 MAPK通路后,穿過(guò)聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞數(shù)減少,提示通路抑制后S100A8/S10

8、0A9蛋白誘導(dǎo)三株鼻咽癌細(xì)胞系侵襲遷移能力減弱;Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白,SB230580預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin表達(dá)下調(diào); qRT-PCR檢測(cè)MMPs基因的表達(dá)變化,三株鼻咽癌細(xì)胞存在不同,CNE1細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP3、MMP7和MMP9實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)下調(diào),尤其是MMP7下調(diào)尤為明顯;CNE2細(xì)胞SB230580預(yù)處理組僅有MMP1、MMP2和