TLR4-snail信號通路在LPS誘導的人膽管上皮細胞EMT中作用初步研究.pdf

1、目的：膽管?。–holangiopathies）泛指以膽管上皮細胞（biliary epithelial cells,BECs）為主要攻擊靶點的一類疾病，其本質(zhì)是膽管上皮細胞受損后，上皮化的功能單位發(fā)生改建和纖維化。研究表明膽管纖維化常伴隨膽道的慢性感染。Toll樣受體4（Toll-like recepter，TLR4）作為炎癥反應調(diào)節(jié)及細胞信號傳導的關鍵，其本身又是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的天然受體。我們

2、在前期的研究中發(fā)現(xiàn)TLR4可參與活化并激活由LPS介導的膽管上皮細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象，但其具體機制尚有待研究。TLR4是否是BECs發(fā)生EMT的關鍵節(jié)點，以及下調(diào)TLR4能否抑制EMT，從而阻止膽道纖維化的發(fā)展？這一問題已成為研究的熱點。本研究旨在通過針對人膽管上皮細胞（human biliary epithelial cell lines，HIBEipC）TLR4的小干擾RNA病毒載體（LV-TLR4-RNAi），體外對HIBEpiC進

3、行轉(zhuǎn)染實驗，降低TLR4 mRNA表達，觀察LPS介導的EMT逆轉(zhuǎn)情況。探討LPS介導的EMT過程中，TLR4可能扮演的角色，以及核轉(zhuǎn)錄因子snail在EMT中可能發(fā)揮的調(diào)控作用。以期為以膽管纖維化為主要特點的膽道疾病的臨床藥物治療尋找新的靶點，和提供新的思路。
　　方法：將購買的人膽管上皮細胞株（human biliary epithelial cell lines，HIBEpiC）進行培養(yǎng)后，分別設立①control組（未感染

4、任何病毒的正常細胞組）；②control+LPS組（LPS誘導未感染病毒細胞組）；③NC+LPS組（negative control+LPS，LPS誘導陰性對照病毒感染組）進行實驗；④KD+LPS組（knock down+LPS，LPS誘導 RNAi靶點病毒感染組）。②組將正常HIBEpiC與LPS共同培養(yǎng)；④組將TLR4的小干擾RNA病毒載體LV-TLR4-RNAi轉(zhuǎn)染至正常HIBEpiC，收集感染率＞80％的細胞與LPS共同培養(yǎng)；③

5、組用陰性病毒CON077相同步驟進行細胞轉(zhuǎn)染和LPS刺激。分別取0h、14h、24h、48h和72h等不同時相點，通過熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后，膽管上皮細胞E-cadherin、TLR4和snail mRNA水平表達變化情況。①、②、③、④組分別進行兩兩比較，結果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1. LPS誘導正常HIBEpiC，14h、24h、48h、72h后細胞

6、間排列變得松散，細胞呈現(xiàn)長梭形改變，細胞突起增多。隨誘導時間延長，細胞形態(tài)越接近成纖維細胞樣形態(tài)。而刺激慢病毒轉(zhuǎn)染后的HIBEpiC，相同時相觀察細胞接近正常上皮樣細胞形態(tài)，細胞大小基本一致，細胞形態(tài)各異，呈圓形、橢圓形、多邊形等。提示：TLR4-siRNA可抑制LPS誘導的HIBEpiC發(fā)生EMT。
　　2. LPS刺激HIBEpiC后14h即可檢測到TLR4 mRNA表達量較正常HIBEpiC明顯升高（P＜0.01），隨培養(yǎng)時

7、間延長，一直維持在較高水平。而④組經(jīng)LV-TLR4-RNAi病毒轉(zhuǎn)染的HIBEpiC，在LPS刺激下可檢測到TLR4 mRNA表達下降，0h、14h、24h、48h和72h敲減效率分別為73.5%、81.5%、89.9%、93.9%和82.6%；LPS刺激TLR4-siRNA后的HIBEpiC，0h即出現(xiàn)TLR4 mRNA表達量較③組明顯下降，至72h未見升高趨勢（P＜0.01）。結果說明病毒轉(zhuǎn)染成功，TLR4-siRNA可特異性沉默T

8、LR4 mRNA表達。
　　3. LPS刺激HIBEpiC，14h后可觀察到鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail較正常細胞的表達量升高，繼續(xù)培養(yǎng)至24h、48h，其表達仍維持較高水平（P＜0.01）。同樣與③組比較，TLR4-siRNA的HIBEpiC，snail的表達隨培養(yǎng)時間的延長，表達量降低，14h、24h、48h最明顯（P＜0.01）。說明TLR4-siRNA可下調(diào)snail在HIBEpiC上的表達。
　　4. LPS刺激可誘導H

9、IBEpiC發(fā)生EMT現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為上皮標志物E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平受到明顯抑制，②組經(jīng)LPS刺激，14h起至72h內(nèi)，可觀察到E-cadherin表達持續(xù)下降（P＜0.01）。而在TLR4-siRNA干擾后，與③組間比較，TLR4被阻斷14~48h均能檢測到E-cadherin的表達量出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.01）。說明TLR4-siRNA干擾后可抑制E-cadherin下調(diào)。
　　5. LPS刺激陰性對照病毒轉(zhuǎn)染后的HIB

10、EpiC，各時相點檢測到的EMT相關目的基因表達情況與②組表達情況基本相符，P＞0.05差異無統(tǒng)計學意義。說明病毒載體本身對本實驗結果無影響。
　　結論：
　　1.通過RNA干擾技術沉默TLR4基因表達，可有效抑制LPS誘導的膽管上皮細胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化；
　　2.沉默TLR4的HIBEpiC中，上皮標志物明顯升高，EMT現(xiàn)象受到了明顯的抑制；
　　3.轉(zhuǎn)錄因子snail是EMT過程中重要的信號分子，在模擬的膽