超聲微泡靶向增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，近年來(lái)基因治療的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步。在基因療法的研究中，基因傳輸方法是成功進(jìn)行基因治療的一個(gè)關(guān)鍵步驟，其中非侵襲、靶向的基因輸送系統(tǒng)因其諸多優(yōu)點(diǎn)成為基因療法研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，在臨床上具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。雖然傳統(tǒng)的病毒基因載體具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，但該類方法的安全性和長(zhǎng)期療效受到質(zhì)疑，限制了其臨床應(yīng)用。近幾年，非病毒基因載體引起了研究者的關(guān)注并得到了廣泛研究。但目前的研究表明，單純的非

2、病毒載體基因轉(zhuǎn)染率不高，導(dǎo)致基因治療效果明顯受限。超聲靶向微泡破壞技術(shù)(Ultrasound—targeted microbubble destruction，UTMD)是一種靶向、高效、有廣闊應(yīng)用前景的非病毒基因輸送新策略，其通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞膜聲孔作用，增加膜通透性，進(jìn)而有效促進(jìn)大分子物質(zhì)的胞內(nèi)傳輸，且可避免其他基因傳輸方法的副作用。在該類方法的研究中，UTMD的參數(shù)設(shè)置與優(yōu)化組合對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率有至關(guān)重要的影響。本論文將對(duì)UTMD的參數(shù)進(jìn)

3、行詳細(xì)分析與優(yōu)化，為靶向、高效、無(wú)創(chuàng)的基因治療研究提供一種可行的實(shí)驗(yàn)方案；同時(shí)嘗試將物理(UTMD)和化學(xué)(PEI)的基因轉(zhuǎn)染策略有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，探究一種有效的基因傳輸與基因轉(zhuǎn)染方法；嘗試運(yùn)用UTMD轉(zhuǎn)染靶向Survivin基因的短發(fā)夾狀RNA干擾質(zhì)粒，分析基因沉默效應(yīng)、凋亡誘導(dǎo)及增殖抑制作用，開(kāi)創(chuàng)癌癥基因治療的新篇章。本文包括以下三部分：
　　 第一部分：超聲靶向微泡破壞參數(shù)設(shè)置與優(yōu)化增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的研究
　　 目的：①

4、探討不同超聲及轉(zhuǎn)染參數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞活力、基因傳輸和聲孔作用的影響，優(yōu)化超聲靶向微泡破壞(UTMD)參數(shù)，減少對(duì)細(xì)胞活力和質(zhì)粒完整性的影響；②比較不同聲學(xué)微泡對(duì)體外基因轉(zhuǎn)染的作用及其安全性；⑧探討優(yōu)化的UTMD參數(shù)對(duì)裸鼠人宮頸癌(Hela)皮下移植瘤基因的靶向傳輸效率。
　　 方法：
　　 體外研究：①懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)Hela細(xì)胞，設(shè)置不同超聲強(qiáng)度、占空比及輻照時(shí)間，比較其對(duì)細(xì)胞活力及紅色熒光蛋白基因(DsRed

5、)表達(dá)效率的影響；②顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜表面的超微結(jié)構(gòu)；⑧系統(tǒng)比較不同轉(zhuǎn)染參數(shù)組合、不同質(zhì)粒[DsRed和熒光素酶質(zhì)粒(Pcmv—LUC)]對(duì)細(xì)胞活力及基因表達(dá)效率的影響，分析UTMD對(duì)基因轉(zhuǎn)染的增強(qiáng)作用，瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒完整性；④分析脂質(zhì)體微泡(LM)的增效作用，對(duì)微泡濃度、超聲參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用最優(yōu)參數(shù)對(duì)不同細(xì)胞系(HepG2、Ishikawa、MCF-7和B16-F10)行超聲處理，并與SonoVue微泡、聚

6、乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行比較。
　　 體內(nèi)研究：將兩種報(bào)告質(zhì)粒(EGFP、DsRed)經(jīng)裸鼠尾靜脈注入，對(duì)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間(1～7 d)、質(zhì)粒用量(20～50μg)、靶向性和安全性進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 體外研究：①高聲強(qiáng)和高占空比顯著降低細(xì)胞存活率(P<0.01)，導(dǎo)致細(xì)胞脫離。細(xì)胞培養(yǎng)方式和三種超聲參數(shù)均有顯著的交互作用(P<0.01)；貼壁培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞活力隨著占空比的增加、輻照時(shí)間的延長(zhǎng)

7、而逐步降低。懸浮培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)相同超聲參數(shù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，存活率無(wú)明顯下降；②電鏡結(jié)果顯示，適當(dāng)條件的超聲輻照能導(dǎo)致細(xì)胞表面出現(xiàn)可逆性孔道。懸液培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)1.0 W/cm2、20％占空比的輻照3 min后，聲孔作用最強(qiáng)；⑧當(dāng)質(zhì)粒濃度達(dá)到30μg/孔時(shí)，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率均最高。與單純超聲輻照相比，UTMD可顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率(P<0.01)。④電泳結(jié)果表明，質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的完整性不受優(yōu)化參數(shù)影響；⑤超聲輻照聯(lián)合LM處理后基因轉(zhuǎn)染率顯

8、著增加(P<0.01)；當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞暴露于最優(yōu)條件時(shí)，不同細(xì)胞類型對(duì)超聲的反應(yīng)性不同。
　　 體內(nèi)研究：P+UTMD組內(nèi)熒光表達(dá)顯著高于P組、P+US組或P+LM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，基因表達(dá)的最佳時(shí)間是第3 d(P<0.01)，兩種不同報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染率較一致，非靶向器官未見(jiàn)明顯基因表達(dá)且未觀察到明顯的組織損傷。
　　 結(jié)論：①不同超聲和轉(zhuǎn)染參數(shù)、培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞活力和基因傳輸效率有較大影響，對(duì)其優(yōu)化后可產(chǎn)

9、生較強(qiáng)的聲孔作用，減少細(xì)胞損傷；②聲學(xué)微泡對(duì)超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染有顯著的增效作用，UTMD是一種有效的體外基因輸送方法；⑧UTMD能顯著增加體內(nèi)報(bào)告基因轉(zhuǎn)染，是一種高效、非侵襲性的基因轉(zhuǎn)染方法。
　　 第二部分：超聲靶向微泡破壞聯(lián)合聚乙烯亞胺增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的研究
　　 目的：①分析UTMD聯(lián)合PEI增強(qiáng)癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的最優(yōu)體外條件及協(xié)同作用；②探討UTMD聯(lián)合PEI增強(qiáng)裸鼠移植瘤基因輸送的可行性和應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法

10、：
　　 體外研究：①制備PEI/Pcmv—LUC復(fù)合物用于乳腺癌細(xì)胞(MCF一7)基因轉(zhuǎn)染，以不同方式孵育微泡/轉(zhuǎn)染復(fù)合物，通過(guò)熒光素酶活性和細(xì)胞存活率測(cè)定，對(duì)超聲輻照參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)質(zhì)粒濃度、孵育時(shí)間、血清、溶媒類型、培養(yǎng)基體積等因素進(jìn)行分析。②將不同質(zhì)粒DNA(DsRed、Pcmv-LUC)與不同分子量PEI(25 kDa、750 kDa)以不同的N/P比制備PEI/DNA復(fù)合物，利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析PEI/DNA復(fù)合物的

11、混合比例，MTT法測(cè)定PEI的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)不同分子量PEI對(duì)基因轉(zhuǎn)染的影響及超聲輻照的增強(qiáng)作用。
　　 體內(nèi)研究：經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈分別注入PBS、質(zhì)粒、質(zhì)粒+SonoVue微泡、PEI/DNA復(fù)合物+SonoVue微泡，僅對(duì)一側(cè)腫瘤行超聲輻照，另一側(cè)腫瘤作為對(duì)照，對(duì)基因轉(zhuǎn)染和組織學(xué)檢查進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 體外研究：①適當(dāng)條件的超聲輻照可促進(jìn)PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染，UTMD聯(lián)合PEI的轉(zhuǎn)染效率顯著高

12、于單純超聲輻照和PEI轉(zhuǎn)染(P<0.01)。超聲輻照前細(xì)胞與PEI/DNA復(fù)合物共孵育2 h時(shí)，熒光素酶活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)。②瓊脂糖凝膠電泳顯示，N/P比≥3時(shí)，PEI可有效地縮合質(zhì)粒DNA，兩種PEI及兩種質(zhì)粒DNA的電泳情況相似。細(xì)胞毒性與PEI濃度相關(guān)。②單獨(dú)超聲輻照能提高裸質(zhì)粒和PEI/DNA復(fù)合物的熒光素酶活性(P<0.05)，但前者的增加幅度顯著小于后者(P<0.05)，25 kDa顯著優(yōu)于750 kDa(P<0.

13、01)。
　　 體內(nèi)研究：UTMD聯(lián)合PEI可顯著增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染，受輻照移植瘤的熒光素酶活性增加了10倍(P<0.01)；與非聯(lián)合PEI時(shí)比較，熒光素酶表達(dá)增加了111倍(P<0.01)。無(wú)論有否超聲照射，裸鼠其他器官組織中均無(wú)明顯的基因表達(dá)(P>0.05)，且未觀察到明顯的組織損傷。
　　 結(jié)論：①UTMD聯(lián)合PEI對(duì)基因轉(zhuǎn)染有協(xié)同作用，是一種增強(qiáng)質(zhì)粒DNA基因表達(dá)簡(jiǎn)單而有應(yīng)用前景的方法，優(yōu)化的超聲和轉(zhuǎn)染參數(shù)能顯著提高體

14、外癌細(xì)胞的基因表達(dá)效率。②UTMD聯(lián)合PEI可顯著增強(qiáng)報(bào)告基因在腫瘤組織的靶向傳輸和轉(zhuǎn)染，是一種很有前景、新型而安全的體內(nèi)基因輸送方法，為基因治療提供一種高效的新方法。
　　 笫三部分：超靶向微泡破壞聯(lián)合RNAi沉默Survivin表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究
　　 目的：①構(gòu)建靶向Survivin基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，研究RNA干擾技術(shù)(RNAi)對(duì)凋亡抑制因子Survivin的降調(diào)節(jié)作用；②通過(guò)UTMD聯(lián)合RNA

15、i，觀察體內(nèi)外Survivin基因的沉默效應(yīng)、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)和增殖抑制作用。
　　 方法：①構(gòu)建三個(gè)靶向Survivin基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒(Psiren/S1/S2/S3)和對(duì)照質(zhì)粒(Psiren/con)。②體外研究：通過(guò)UTMD或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染篩選，將最優(yōu)重組質(zhì)粒進(jìn)行詳細(xì)研究，應(yīng)用FITC—annexin V和7-AAD雙染、DNA ladder分析細(xì)胞凋亡，RT—PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Mrna及蛋白表達(dá)的變化。⑧

16、體內(nèi)研究：將荷瘤裸鼠分三組：質(zhì)粒+超聲輻照組(P+US)，質(zhì)粒+微泡+超聲輻照組(P+UTMD)，對(duì)照組(C)。對(duì)組織樣本行冰凍切片、組織學(xué)檢查、采用免疫組化檢測(cè)移植瘤Survivin、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ki-67、核干細(xì)胞因子(NS)、p53蛋白在各組腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)，采用CD34標(biāo)記、測(cè)定微血管密度(MVD)，應(yīng)用TUNEL法分析凋亡指數(shù)(AI)。
　　 結(jié)果：①酶切和測(cè)序分

17、析證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。②體外研究：RT—PCR和蛋白質(zhì)印跡法表明，Psiren/S3的抑制效果最顯著。流式細(xì)胞分析顯示，P+L組的細(xì)胞凋亡率(31.58％±3.12％)顯著高于各對(duì)照組(P<0.01)，但仍低于P+UTMD組(43.86％±4.44％，P<0.01)；DNA ladder顯示，脂質(zhì)體或UTMD轉(zhuǎn)染處理后可檢測(cè)到明顯凋亡條帶；P+UTMD組的Survivin Mrna及蛋白表達(dá)抑制率為83.33％±2.73％和79.67

18、％±3.55％，均顯著高于其他各組(P<0.01)。③體內(nèi)研究：P+UTMD組的PCNA、Ki-67、Bcl-2、Survivin及NS蛋白表達(dá)下降，而B(niǎo)ax、Caspase-3和P53蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，MVD明顯減少，AI明顯增加，與C組及P+US組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：Survivin可作為癌癥基因治療的理想靶標(biāo)，UTMD聯(lián)合shRNA干擾技術(shù)能顯著阻抑靶基因Survivin的表達(dá)，有效誘導(dǎo)