聲學(xué)微泡聯(lián)合超聲靶向介導(dǎo)耐藥基因ASON轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)肝癌MDR.pdf

1、第一部分 肝癌MDR細(xì)胞模型建立和生物學(xué)特性研究 目的：建立人肝癌QGY多藥耐藥細(xì)胞模型并初步檢測其耐藥特性。 方法：以人肝癌細(xì)胞株QGY為親本細(xì)胞，選用化療藥物順鉑，以低濃度遞增加量一間歇作用法誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥。光鏡、電鏡觀察新建細(xì)胞株組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。測定細(xì)胞倍增時(shí)間并繪制生長曲線、觀察細(xì)胞克隆形成和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，鑒定新建細(xì)胞生物學(xué)特性。四甲基偶氮唑鹽法測定細(xì)胞藥物敏感性，免疫組化檢測細(xì)胞耐藥蛋白P

2、-gp、MRP和LRP，凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。 結(jié)果：成功建立MDR細(xì)胞株QGY/CDDP。QGY/CDDP在組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)上與親本細(xì)胞QGY無明顯差別。 結(jié)論：新建細(xì)胞株QGY/CDDP具有MDR特性，其耐藥機(jī)制由MRP和P-gp介導(dǎo)，以MRP介導(dǎo)機(jī)制為主，LRP、Bcl-2/Bax可能不參與QGY/CDDP耐藥性的形成。 第二部分聲學(xué)微泡聯(lián)合超聲靶向介導(dǎo)耐藥基因ASON轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞MDR

3、的效應(yīng)和機(jī)制 目的：初步討論聲學(xué)微泡聯(lián)合超聲靶向介導(dǎo)耐藥基因ASON轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌細(xì)胞株MDR的效應(yīng)和作用機(jī)制。 方法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整成單細(xì)胞懸液，分別給于mdrl-ASON+聲學(xué)微泡+超聲、mrp-ASON+聲學(xué)微泡+超聲實(shí)驗(yàn)處理，待細(xì)胞生長良好，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測：在QGY/CDDPQ細(xì)胞，MTT法測定細(xì)胞耐藥性變化，細(xì)胞貼壁率測定、細(xì)胞周期分布檢測(FCM)、細(xì)胞凋亡TUN

4、NEL法測定，觀察細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)處理后的生物學(xué)特性變化，RT-PCR檢測mdr1、mrp基因的mRNA表達(dá)，Westem-blot測定細(xì)胞P-gp、MRP蛋白表達(dá)，免疫組化測定細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)。在HepG2/ADM細(xì)胞，AO/EB熒光法測定細(xì)胞凋亡，其它檢測方法與QGY/CDDP實(shí)驗(yàn)處理后細(xì)胞檢測一致。 結(jié)果：HepG2/ADM細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處理后，細(xì)胞藥物敏感性、細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞周期分布、凋亡細(xì)胞、耐藥基因mRNA表

5、達(dá)、耐藥蛋白的相對表達(dá)量和凋亡蛋白陽性細(xì)胞百分率等共七項(xiàng)檢測指標(biāo)均顯示細(xì)胞有一定的變化，且與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；同樣可見mdr1-ASON處理中，細(xì)胞的指標(biāo)變化大于mrp-ASON處理。 結(jié)論：mdrl-ASON+聲學(xué)微泡+超聲照射與mrp-ASON+聲學(xué)微泡+超聲照射能夠部分逆轉(zhuǎn)QGY/CDDP、HepG2/ADM人肝癌細(xì)胞的MDR。聲學(xué)微泡結(jié)合超聲比陽離子脂質(zhì)體結(jié)合超聲有更好的轉(zhuǎn)染基因ASON靶向介導(dǎo)作用

6、，顯示對肝癌細(xì)胞株MDR更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。在QGY/CDDP細(xì)胞，mrp-ASON轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)MDR的作用明顯強(qiáng)于mdr1-ASON轉(zhuǎn)染；在HepG2/ADM細(xì)胞，mdr1-ASON、mrp-ASON轉(zhuǎn)染均有較強(qiáng)逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用，mdr1-ASON轉(zhuǎn)染的MDR逆轉(zhuǎn)作用更強(qiáng)。 第三部分裸鼠肝癌MDR移植瘤模型的建立和生物學(xué)特性研究 目的：建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM多藥耐藥的裸鼠移植瘤模型并鑒定其耐藥特性。

7、 方法：取對數(shù)生長期QGY/CDDP、HepG2/ADM細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)分組，采用細(xì)胞懸液皮下直接注射法，將MDR腫瘤細(xì)胞接種在裸鼠皮下，觀察腫瘤生長并記錄。待皮下移植瘤生長到一定大小，各組隨機(jī)取兩只裸鼠處死，剝離移植瘤組織塊，提取移植瘤細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行耐藥性檢測。光鏡、電鏡觀察移植瘤細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。進(jìn)行移植瘤細(xì)胞倍增時(shí)間并繪制生長曲線和細(xì)胞克隆形成率測定，觀察移植瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性

8、。MTT測定移植瘤細(xì)胞藥物敏感性，F(xiàn)CM檢測移植瘤細(xì)胞P-gp、MRP表達(dá)，Western-blot測定細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)。 結(jié)果：QGY/CDDP、HepG2/ADM荷瘤裸鼠的平均生存期為40±15d，兩株細(xì)胞移植瘤生長均較其對應(yīng)非耐藥移植瘤細(xì)胞慢，有顯著性差異。MDR移植瘤細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)與對應(yīng)非耐藥移植瘤細(xì)胞無明顯差異。移植瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測：兩株細(xì)胞均呈現(xiàn)細(xì)胞倍增時(shí)間延長，細(xì)胞克隆形成率降低

9、。MTT法結(jié)果：兩株MDR移植瘤細(xì)胞均對ADM、CDDP、5-FU和AsT四種藥物耐藥，QGY/CDDP移植瘤細(xì)胞對CDDP的RI最高，HepG2/ADM細(xì)胞對ADM的RI最高，與各自非耐藥移植瘤細(xì)胞比較差異具有顯著性差異(P<0.05)。耐藥蛋白與凋亡蛋白測定結(jié)果：在QGY/CDDP移植瘤細(xì)胞，MRP蛋白染色陽性細(xì)胞率最高，為23.85％(P<0.05)，P-gp染色陽性細(xì)胞率為7.44％(P<0.05)；Bcl-2和Bax的相對表達(dá)

10、與移植瘤QGY細(xì)胞接近(P>0.05)。在HepG2/ADM移植瘤細(xì)胞，P-gp蛋白染色陽性細(xì)胞率最高，為84.97％，MRP染色陽性細(xì)胞率為10.26％，Bcl-2和Bax的相對表達(dá)與移植瘤HepG2細(xì)胞比較有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：成功建立人肝癌QGY/CDDP、HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型。其耐藥機(jī)制可能主要與mdrl及蛋白P-gp、mrp及蛋白MRP(P190)和凋亡蛋白Bcl-2/bax的表達(dá)有關(guān)。

11、本移植瘤模型成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，生物學(xué)特性穩(wěn)定。 第四部分聲學(xué)微泡聯(lián)合超聲靶向介導(dǎo)耐藥基因ASON轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)裸鼠肝癌移植瘤MDR的效應(yīng)和機(jī)制 目的：初步探討聲學(xué)微泡聯(lián)合超聲靶向介導(dǎo)耐藥基因ASON轉(zhuǎn)染在體逆轉(zhuǎn)裸鼠肝癌移植瘤MDR的效應(yīng)及其作用機(jī)制。 方法：對于肝癌MDR移植瘤裸鼠，按實(shí)驗(yàn)分組在體給于實(shí)驗(yàn)處理： QGY/CDDP移植瘤給于mrp-ASON+聲學(xué)微泡+超聲，HepG2/ADM移植瘤給于mdr1-ASO

12、N+聲學(xué)微泡+超聲，并以相應(yīng)ASON+陽離子脂質(zhì)體+超聲為陽性對照，相應(yīng)MDR移植瘤+轉(zhuǎn)染液注入為陰性對照，在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死裸鼠，剝離移植瘤塊，提取相應(yīng)移植瘤細(xì)胞培養(yǎng)。取對數(shù)生長期培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行MTT藥敏檢測、RT-PCR測定細(xì)胞mdr1及mrp基因mRNA表達(dá)、Western-blot檢測細(xì)胞P-gp及MRP蛋白表達(dá)、免疫組化測定細(xì)胞凋亡蛋白bcl-2及bax表達(dá)和移植瘤細(xì)胞膜ATPase活性變化測定。 結(jié)果：裸鼠肝癌移植瘤在體

13、實(shí)驗(yàn)處理后，移植瘤細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)：mrp-ASON+聲學(xué)微泡+超聲作用QGY/CDDP移植瘤后，與陰性對照組比較，移植瘤細(xì)胞對CDDP、ADM、5-FU和AsT四種藥物的耐藥性明顯下調(diào)(P<0.05)，與陽性組比較，耐藥性有一定下調(diào)，但差異無顯著性意義(P>.05)，RI降低。RT-PCR顯示：移植瘤細(xì)胞mrp基因的mRNA表達(dá)下降明顯(對mdr1基因的tuRNA表達(dá)影響較小)，較對照組有顯著性差異(P<0.05)。Western-blo

14、t結(jié)果：移植瘤細(xì)胞P-gp、MRP表達(dá)均有一定下降(MRP絕對值大于P-gp)，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫組化結(jié)果表明：移植瘤細(xì)胞bcl-2、bax有一定變化，與對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。細(xì)胞膜ATPase活性變化測定可見：移植瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜ATPase活性有一定上調(diào)，但與對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。mdr1-ASON+聲學(xué)微泡+超聲作用HepG2/ADM移植瘤后，移植瘤細(xì)

15、胞對ADM、CDDP、5-FU和AsT四種藥物耐藥性明顯下調(diào)，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，RI降低。RT-PCR顯示：移植瘤細(xì)胞mdr1基因和mrp基因的mRNA表達(dá)明顯下降，較對照組有顯著性差異(P<0.05)。Western-blot結(jié)果表明：移植瘤細(xì)胞P-gp、MRP表達(dá)明顯下降(P-gp絕對值大于MRP)，與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。凋亡蛋白的免疫組化測定結(jié)果顯示：移植瘤細(xì)胞bcl-2、bax明顯變化