超聲靶向微泡介導(dǎo)CD133-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CD133+肝癌干細(xì)胞生物學(xué)特性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　原發(fā)性肝癌為全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌治療的預(yù)后差與其高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞中存在一些具有自我更新能力的特殊亞群，稱為腫瘤干細(xì)胞或腫瘤啟始細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞具有維持和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的特性，可能是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療抵抗的根源。
　　CD133是由PROM-1基因編碼的5次跨膜糖蛋白，作為分離培養(yǎng)和鑒定肝癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一。CD133+肝癌細(xì)胞在自我更新、增殖、分化、成瘤、放

2、化療抵抗等方面均表現(xiàn)出干細(xì)胞的特性，CD133還與腫瘤的惡性進(jìn)展、預(yù)后及復(fù)發(fā)率密切相關(guān)。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞在某些基因和特定環(huán)境作用下轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程，其在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)展以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。目前研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞之間有著密切的關(guān)聯(lián)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的特性。
　　超聲靶向微泡破壞作為一種新型的基因傳輸方法及靶向給藥系統(tǒng)備受關(guān)注，它可以成功地

3、將RNA干擾技術(shù)和聲脈沖、超聲等技術(shù)相結(jié)合，提高局部組織、細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)入效率和靶向性，有望成為一種安全、簡(jiǎn)便、高效的基因治療方法。
　　本研究的目的在于探討超聲靶向微泡介導(dǎo)shRNA對(duì)CD133+肝癌干細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的可行性，并且比較不同轉(zhuǎn)染方式的基因轉(zhuǎn)染效率差異；研究超聲靶向微泡介導(dǎo)CD133-shRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)CD133+肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲能力以及成瘤能力影響；研究超聲靶向微泡介導(dǎo)CD133-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CD

4、133+肝癌干細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)SMMC-7721肝癌細(xì)胞，通過(guò)流式分選CD133+SMMC-7721肝癌細(xì)胞，檢測(cè)分選前后CD133表達(dá)情況；通過(guò)成球試驗(yàn)、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定分選的肝癌干細(xì)胞；
　　2.將分選的CD133+SMMC-7721肝癌干細(xì)胞分為三組：對(duì)照組(Control)，質(zhì)粒+脂質(zhì)體組（P+L）；質(zhì)粒+超聲輻照微泡組（P+UTMD）分別按條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染

5、，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，以及熒光定量PCR（qRT-PCR）、Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞CD133 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3.通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組肝癌細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因CD44、CD90、Oct4、Sox2的表達(dá)情況；成球試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的自我更新能力；CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的變化；Tran

6、swell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲及遷移能力的變化；構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，將轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞注入隨機(jī)分組裸鼠皮下，觀察裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況。
　　4. qRT-PCR、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cadherin蛋白）和間葉細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin和vimentin蛋白）的表達(dá)情況，免疫組化檢測(cè)裸鼠瘤組織上述EMT標(biāo)記物的表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)NF-κB通路表達(dá)情況。
　　

7、結(jié)果：
　　1.利用流式分選技術(shù)成功從SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中分選出CD133+肝癌干細(xì)胞。流式分選檢測(cè)結(jié)果顯示，分選前SMMC-7721肝癌細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞比例為0.2-2％，分選后CD133+細(xì)胞的比例可達(dá)90%；CD133+肝癌干細(xì)胞在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)條件下成團(tuán)生長(zhǎng)，數(shù)量變多，體積變大。成球?qū)嶒?yàn)，CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明，CD133+SMMC-7721肝癌干細(xì)胞有較高的成球能力、增殖能力及成

8、瘤能力。
　　2.熒光顯微鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD133-shRNA轉(zhuǎn)染后，超聲微泡轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組相比，有較強(qiáng)的熒光表達(dá)；流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染組CD133表達(dá)低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P＜0.05）。
　　3. qRT-PCR結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染組細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)基因CD44

9、、CD90、Oct4、Sox2的mRNA水平低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和對(duì)照組（P＜0.05）；成球?qū)嶒?yàn)、CCK-8及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，超聲微泡組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的自我更新能力、增殖及克隆形成能力低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組（P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率增高（P<0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲微泡轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移、侵襲能力及成瘤能力低于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和對(duì)照組（P<0.05)。
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10、. qRT-PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組相比，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白升高，而間葉細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)降低（P<0.05)；另外，通過(guò) Western Blot檢測(cè)了 NF-κB經(jīng)典通路 IKKβ/IκBα/RelA及p-IKKβ、p-IκBα、p-RelA蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡介導(dǎo)CD133-shRNA轉(zhuǎn)染肝癌干細(xì)胞后p

11、-IKKβ、p-IκBα、p-RelA表達(dá)均降低（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1. CD133+SMMC-7721細(xì)胞具有較強(qiáng)的成球、增殖能力及體內(nèi)成瘤能力，是具有腫瘤干細(xì)胞特性的肝癌細(xì)胞亞群。
　　2.超聲靶向微泡破壞介導(dǎo)的CD133-shRNA轉(zhuǎn)染后能顯著下調(diào)CD133+肝癌干細(xì)胞CD133的表達(dá)，并抑制其增殖、侵襲及成瘤能力。
　　3.超聲靶向微泡破壞介導(dǎo)的CD133-shRNA轉(zhuǎn)染后CD133+肝癌