超聲微泡攜magl-shrna靶向釋放對大鼠肝細胞肝癌轉移作用的實驗研究

1、超聲微泡攜MAGLshRNA靶向釋放對大鼠肝細胞肝癌轉移作用的實驗研究陳懿1王曉波2張俊勇1連崢嶸1龔建平1【摘要】目的觀察超聲微泡攜單?；视椭久赋聊颍╩onoacylglycerollipaseshthairpinRNAMAGLshRNA)在大鼠肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC)組織中轉染及對HCC轉移的作用。方法建立大鼠肝細胞肝癌模型，病理解剖和二維超聲驗證肝臟成瘤情況。抽取48只SD大鼠隨機

2、分成四組，分別為PBS液組、MAGLshRNA質粒微泡組(MAGLshRNAmicrobubbleMB)、空白質粒微泡超聲輻照組(microbubblesultrasoundMBUS)、MAGLshRNA質粒微泡超聲輻照組(MAGLshRNAMBUS)。每只注射1ml，對MBUS組和MAGLshRNAMBUS組大鼠肝區(qū)同時給予超聲輻照，輻照條件為300kHz，2Wcm2，輻照10s，間隔10s，共20min。WesternBlot檢測大

3、鼠HCC組織MAGL蛋白的表達，免疫組化檢測MAGL和基質金屬蛋白酶2（matrixmetalloproteinase2MMP2）的表達。比較各組動物的腫瘤轉移情況。結果MAGL在HCC組織中表達明顯高于正常肝組織(P0.05)；微泡攜MAGLshRNA可以在HCC組織被超聲輻照擊破后靶向釋放，在各組HCC組織中均有MAGL蛋白的表達，其中MAGLshRNAMBUS組表達量明顯低于其它組(P0.01)；免疫組化檢測MAGLshRNAMB

4、US組MMP2表達均低于其它組(P0.01)；各組動物均見腫瘤轉移，但MAGLshRNAMBUS組轉移率最低(P0.01)。結論超聲輻照可破壞攜MAGLshRNA的微泡使之靶向釋放并增強了MAGLshRNA的轉染效率，MAGLMMP2通路可能與HCC的轉移相關。【關鍵詞】肝細胞肝癌；單酰基甘油脂肪酶；基因；超聲微泡；轉移——————————————基金項目：重慶市衛(wèi)生局重點科研項目（20111123）（1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外

5、科400010；2.重慶市涪陵中心醫(yī)院肝膽外科408000）[作者簡介作者簡介]陳懿（19874），男，四川成都人，研究方向：肝膽外科學，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科。Tel：13637970778Email:chenyi9587@[通訊作者通訊作者]龔建平（196111），男，四川宜賓人，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽外科學，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科。Tel：13996286589Email:gongjianping

6、11@單?；视椭久福∕onoacylglycerollipaseMAGL）是一種脂代謝關鍵酶，其在促進腫瘤的發(fā)生，以及增加惡性程度上有重要作用，以RNA干擾和JZL184藥理學阻斷MAGL后腫瘤的生長和轉移明顯被抑制【12】。研究表明，肥胖和脂質代謝紊亂是肝細胞肝癌（HepatocellularcarcinomaHCC)發(fā)生的高危因素【3】，且肝炎病毒感染造成的脂代謝異常以及非酒精性肝脂肪變均有可能是HCC發(fā)生發(fā)展的根本原因【4】。

7、HCC的轉移仍是患者術后長期存活的主要障礙，目前尚無有效的治療手段預防HCC的轉移。近年來超聲輻照破壞攜靶基因的微泡定向釋放技術以它的無創(chuàng)、安全、高效、靶向性好及不引起免疫反應的優(yōu)點已經成為肝癌基因治療的熱點和方向【5.6】。本研究通過超聲微泡技術靶向轉染MAGLshRNA，特異性抑制HCC細胞內MAGL的表達，探究以MAGL為靶點調節(jié)脂質代謝為手段抑制HCC轉移的可行性以及機制。1.材料及方法1.1.實驗動物：健康SPF級雄性SD大鼠

8、60只，體質量(216.516.2)g8周齡，購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。所有動物分籠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學SPF級實驗動物房，采用標準化光照，自由飲水、進食，定期更換墊料，適應環(huán)境1周。動物使用許可證號:CQLA20112443。實驗過程中對大鼠的飼養(yǎng)和處置均遵循《重慶市實驗動物管理辦法》。1.2.主要儀器及試劑：752型紫外分光光度儀購自日本島津公司，CGZZ型超聲基因轉染治療儀(1MHz)為重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所研制，自制脂質

9、微泡為重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所惠贈。MAGLshRNA質粒購自美國SantaCruz公司，GIGA質粒試劑盒購自美國Qiagen公司，多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。二乙基亞硝胺(DEN)，純度為99.5%，購自美國Sigma公司。抗MAGL抗體購自英國Abcam公司，抗MMP2抗體購自武漢三鷹公司。1.3.大鼠肝癌模型的建立：大鼠適應喂養(yǎng)1周后，從第2周開始給予體積分數0.2%DEN（500ml生理鹽水加1mlDEN，振蕩混勻，

10、避光保存）溶液灌胃，按體質量10mgKg給藥，5次周，至14周停藥。建模后60只大鼠隨機處理5只，給予肝區(qū)二維B超檢測后收集大鼠腫瘤組織作常規(guī)切片，HE染色，經病理診斷均為肝細胞癌，即建立大鼠HCC模型成功。剩余大鼠隨機抽取48只分成4組：分別為PBS液組、MAGLshRNA質粒微泡組(MAGLshRNAMB)、空白質粒微泡超聲輻照組(MBUS)、MAGLshRNA質粒微泡超聲輻照組(MAGLshRNAMBUS)。1.4.質粒提取及攜M

11、AGLshRNA基因微泡的合成：MAGLshRNA質粒轉化JM109大腸桿菌；經氨芐西林篩選出陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中大量擴增細菌；參照GIGA質粒抽提試劑盒說明書大量抽提純化質粒；紫外分光光度計檢測質粒濃度和純度，調整濃度為1mgml，A260A280=1.9，其純度符合實驗要求。參照文獻【7】的方法制備載有MAGLshRNA及賴氨酸的超聲微泡造影劑，調整濃度為0.1μgμl。1.5.治療方法：第15周開始經大鼠尾靜脈注射入載有MAG

12、LshRNA質粒的微泡1ml?？瞻踪|粒微泡超聲輻照組和MAGLshRNA質粒微泡超聲輻照組注射后采用超聲監(jiān)測微泡到達靶組織的情況，輻照條件為300kHz，2Wcm2，輻照10s，間隔10s，共20min【8】。1.6.檢測指標：（1）建模后腫瘤超聲、腫瘤標本及病理觀察：60只大鼠隨機處理5只，給予二維B超檢測后收集大鼠肝癌組織及正常肝組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察腫瘤組織的病理學變化情況，采用免疫組織化學二步法進行染色檢測MAGL蛋白

13、在HCC組織及正常組織中的表達。(2)WesternBlot檢測MAGL蛋白的表達情況：轉染1周后，每組各處死5只大鼠采用WesternBlot檢測MAGL蛋白的表達情況，操作按常規(guī)方法進行：收集大鼠肝癌組織，提取總蛋白，20℃保存。配膠后加入預染蛋白和樣本總蛋白，對各泳道等量上樣行電泳，同步化將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜后室溫下封閉4h，依次加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，室溫下孵育2h，洗膜，顯影，采用QuantityOne

14、軟件分析各組MAGL與內參βactin的表達。(3)轉染后腫瘤組織病理學檢查和免疫組織化學染色：處死大鼠后取出腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片；HE染色，觀察腫瘤組織的病理學變化情況。經蘇木精伊紅染色病理檢查確診后均采用免疫組織化學二步法進行染色檢測MMP2的表達。(4)動物腫瘤轉移情況：每組剩下的7只大鼠喂養(yǎng)至自然死亡，觀察其腫瘤的轉移情況（包括腹壁轉移、結腸轉移、胃轉移、肺轉移等），比較每組大鼠轉移率的差異，轉移率=每組