超聲輻照下攜載ARsiRNA的納米級微泡抑制AIPC生長的實驗研究.pdf

1、背景
　　 前列腺癌是男性高發(fā)的惡性腫瘤之一，常規(guī)去激素治療后多數(shù)會在12-18個月內(nèi)發(fā)展成為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)，目前臨床上對于AIPC缺乏有效的治療方法。雄激素受體(AR)在AIPC的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，利用RNA干擾技術(shù)，阻斷雄激素受體的表達(dá)可以起到治療AIPC的作用并已經(jīng)在體外實驗中取得良好的效果。但同其他腫瘤的基因治療一樣，前列腺癌臨床或體內(nèi)基因治療效果不盡理想，存在基因轉(zhuǎn)染率低，治療基因難以聚集到靶

2、組織內(nèi)等問題，其主要原因是缺乏一種安全、可控、靶向的基因遞送載體。超聲微泡的出現(xiàn)為解決基因治療這一瓶頸問題帶來了希望，超聲微泡介導(dǎo)的靶向基因治療方法既可增強基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況，又能提高基因治療的靶向性，減少全身不良反應(yīng)，與其它方法相比，具有安全、有效、靶向性強等優(yōu)點，是一種很有前景的臨床腫瘤治療技術(shù)。隨著納米醫(yī)學(xué)和超聲造影劑的飛速發(fā)展，納米級超聲微泡成為超聲造影劑的發(fā)展趨勢。與常規(guī)微米級微泡相比，納米級微泡具有較強的穿透力

3、，穩(wěn)定性高，包載率及攜載基因轉(zhuǎn)染效率高等特點，在腫瘤的基因治療和靶向顯影方面逐步體現(xiàn)出其巨大的優(yōu)勢。
　　 研究目的
　　 基于以上研究進展，本研究擬在篩選出最有效的AR siRNA序列基礎(chǔ)之上，利用納米級超聲微泡作為基因遞送載體，制備攜載AR siRNA的納米級超聲微泡，檢測其體內(nèi)外特性，并在超聲輻照下轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞。在細(xì)胞分子生物學(xué)水平評價攜載AR siRNA納米級微泡抑制AR基因的表達(dá)及前列腺癌細(xì)胞生長的效果。為

4、超聲輻照下納米級微泡作為體內(nèi)基因載體治療AIPC腫瘤提供實驗依據(jù)和研究基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.設(shè)計并合成三種靶向于雄激素受體的siRNA，利用當(dāng)今廣泛應(yīng)用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以不同濃度轉(zhuǎn)染AIPC細(xì)胞C4-2，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。RT-PCR和Western blot分別檢測轉(zhuǎn)染后AR mRNA表達(dá)水平和AR蛋白表達(dá)水平。CCK-8分析繪制細(xì)胞生長曲線，觀察C4-2細(xì)胞生長活性并篩選出抑制效果最佳的siRNA靶序列。

5、r>　　 2.通過機械振蕩及低速離心法制備空白納米級微泡，利用多聚賴氨酸法制備攜載AR siRNA的納米級超聲微泡，檢測兩者微泡粒徑，表面電位及微泡與siRNA結(jié)合情況。在裸鼠前列腺癌移植瘤進行造影顯像研究，并與常規(guī)微米級微泡(SonoVue)對比造影效果。
　　 3.超聲輻照下攜載AR siRNA的納米級超聲微泡轉(zhuǎn)染LNCap、C4-2和PC-3三種前列腺癌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染率，篩選最佳超聲輻照條件和微泡濃度范圍。RT

6、-PCR和Weston blot檢測轉(zhuǎn)染后AR mRNA和AR蛋白表達(dá)水平，CCK-8分析繪制細(xì)胞生長曲線，評價AR siRNA沉默靶基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生長的抑制效果。
　　 結(jié)果
　　 1.以100nM最佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后，AR的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞增殖活性顯著降低，并根據(jù)抑制效果篩選出最有效靶序列。
　　 2.熒光顯微鏡下觀察納米級微泡與AR siRNA緊密結(jié)合，并可以通過提高ARs

7、iRNA濃度來增加載基因量。粒徑檢測儀測量平均粒徑(608.2±13.3)nm，Zeta電位(-29.9±6.5)mV。與“SonoVue”比較，納米級微泡體內(nèi)顯影時間較前者顯著延長(P<0.05)，腫瘤中心乏血管區(qū)域顯影效果較好。
　　 3.超聲輻照下攜載AR siRNA的納米級微泡轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，獲得最高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的體外超聲輻照條件為MI=1.2，輻照時長=2min，微泡量/細(xì)胞量=100:1(載基因量18.94×10-9

8、 nmol/個)。轉(zhuǎn)染后24小時光鏡觀察C4-2和LNCap細(xì)胞的裸ARsiRNA+超聲輻照組、裸ARsiRNA+空白納米級微泡+超聲輻照組和攜載ARsiRNA的納米級微泡+超聲輻照組均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化，以48小時變化明顯，主要表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓模糊，形態(tài)萎縮，生長緩慢，而PC-3細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：上述三組C4-2和LNCap細(xì)胞的AR mRNA和AR蛋白表達(dá)分別受到不同程度的抑制，其中攜載

9、ARsiNA的納米級微泡+超聲輻照組的抑制作用最為明顯。CCK8分析結(jié)果顯示：C4-2和LNCap細(xì)胞的上述三組siRNA轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后均可以達(dá)到較明顯的生長抑制效果，其中C4-2細(xì)胞的攜ARsiRNA納米級微泡+超聲輻照組的生長抑制率最高，為64.7%，與其余各組或PC-3轉(zhuǎn)染各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.利用RNAi技術(shù)沉默AR基因，能夠抑制前列腺癌C4-2細(xì)胞的生長活性。<