載基因陽離子納米泡的制備及其抑制AIPC移植瘤生長的研究.pdf

1、背景:
　　近年來基因治療已經(jīng)成為惡性腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)。已有研究通過將治療基因靶向地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)來達(dá)到治療惡性腫瘤的目的,取得了一些進(jìn)展。然而,目前困擾基因治療的主要瓶頸問題之一仍是缺乏安全、有效和穩(wěn)定的基因體內(nèi)傳輸系統(tǒng),常用的基因傳輸載體主要由病毒類載體及非病毒類載體兩類組成。非病毒載體主要有脂質(zhì)體、質(zhì)粒等,其優(yōu)點(diǎn)為具有良好的安全性能,但是同時(shí)存在轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn),嚴(yán)重影響了基因治療的效果。病毒類載體例如慢病毒及腺病毒,雖

2、然有較高的轉(zhuǎn)染效率,但是其具有一定的毒性和免疫原性等缺點(diǎn),臨床應(yīng)用一直受到限制。因此構(gòu)建一種安全性能好、轉(zhuǎn)染效率高的新型基因載體對(duì)基因治療具有極其重要的意義。超聲輻照聯(lián)合微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染(ultrasound and microbubble-mediated gene transfection,UMGT)是近年來發(fā)展起來的一種新型轉(zhuǎn)染技術(shù),其中超聲微泡作為攜載基因的載體,具有安全、便捷、穩(wěn)定、高效等特點(diǎn),不過目前的研究顯示,超聲微泡在

3、攜載治療基因、避免體內(nèi)吞噬、防止體內(nèi)治療基因被降解以及自身粒徑等方面仍存在著諸多不足。
　　前列腺癌的有效治療一直是目前臨床治療的難點(diǎn),特別是雄激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC),我們?cè)谇捌谘芯恐袘?yīng)用多聚賴氨酸法制備了攜載ARsiRNA的納米泡,并在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其能聯(lián)合超聲輻照,將ARsiRNA有效轉(zhuǎn)染至C4-2細(xì)胞(AIPC細(xì)胞),抑制AIPC細(xì)胞的生長。

4、但我們的研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),多聚賴氨酸法是將帶有負(fù)電荷的超聲微泡與帶有正電荷的多聚賴氨酸結(jié)合使微泡表面帶有正電荷,從而能與帶有負(fù)電荷的siRNA結(jié)合,實(shí)現(xiàn)在微泡上攜載基因的目的,此種方法屬于一種間接靜電吸附法,攜載siRNA的穩(wěn)定性較差,雖然在體外實(shí)驗(yàn)中抑制AIPC細(xì)胞生長的效果較好,但是要在體內(nèi)應(yīng)用必須在前期研究的基礎(chǔ)上開發(fā)和制備一種納米泡,其表面直接攜帶正電荷,從而能夠高效、直接地與治療基因(DNA、siRNA和質(zhì)粒)結(jié)合,解決超聲微泡攜

5、載治療基因穩(wěn)定性差的缺點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)聯(lián)合超聲輻照能夠抑制AIPC移植瘤生長的作用。
　　目的:
　　結(jié)合上述研究進(jìn)展和我們前期研究結(jié)果,本研究擬制備一種新型的陽離子納米泡,研究其在體外和體內(nèi)的超聲物理特性與超聲造影特點(diǎn)。探討該陽離子納米泡與不同治療基因(siRNA、質(zhì)粒、抗體)的結(jié)合能力。同時(shí)針對(duì)難治性的 AIPC,制備出攜載ARsiRNA的納米泡,檢測ARsiRNA的攜載量,并以AIPC細(xì)胞及其移植瘤為研究對(duì)象,分別研

6、究攜載ARsiRNA的陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照對(duì)AIPC細(xì)胞和移植瘤生長的影響,進(jìn)一步觀察超聲輻照后細(xì)胞及移植瘤細(xì)胞膜微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,為納米泡作為基因載體聯(lián)合超聲輻照治療腫瘤提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將魚精蛋白與其他脂質(zhì)成分按照一定比例混合,運(yùn)用冷凍干燥及機(jī)械振動(dòng)法制備新型陽離子納米泡,檢測制備的納米泡的粒徑、表面電荷、濃度及其穩(wěn)定性。與微米泡SonoVue相比較,運(yùn)用Philips iu22超

7、聲診斷儀在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中分別檢測納米泡的物理特性和超聲造影特點(diǎn)。
　　2.檢測陽離子納米泡的生物安全性,通過熒光顯微鏡觀察陽離子納米泡攜載siRNA、質(zhì)粒、抗體的能力,同時(shí)通過分光標(biāo)度儀檢測陽離子納米泡的載ARsiRNA量,在體外實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染AIPC細(xì)胞(C4-2),并與脂質(zhì)體相比較,運(yùn)用CCK-8檢測兩種不同轉(zhuǎn)染方法抑制C4-2細(xì)胞生長的能力。
　　3.通過不同分組檢測載ARsiRNA的納米泡聯(lián)合超聲輻照抑制裸鼠AIPC移

8、植瘤生長的能力,通過qRT-PCR及WB檢測處理后移植瘤ARmRNA及AR蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)通過掃描電鏡觀察超聲輻照后AIPC細(xì)胞及其移植瘤細(xì)胞膜表面的變化。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)制備的陽離子納米泡形態(tài)規(guī)則、分布均勻、無明顯聚集,平均粒徑(521.2±37.57)nm,平均濃度為(1.2±0.37)x108/ml,表面Zeta電位(18.5±5.13)mv,陽離子納米泡的粒徑和表面電荷在制備一周內(nèi)保持穩(wěn)定。陽離子納米

9、泡在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都有明顯的造影效果,與SonoVue相比,其在開始顯影時(shí)間、峰值強(qiáng)度等造影參數(shù)方面沒有明顯差別,在移植瘤以及裸鼠肝腎的超聲造影持續(xù)時(shí)間明顯長于后者。陽離子納米泡在裸鼠肝臟、腎臟和前列腺癌移植瘤中增強(qiáng)顯影的持續(xù)時(shí)間約20min,且在移植瘤顯影中陽離子納米泡的分布更為廣泛,能夠在微米級(jí)微泡不能顯影的腫瘤中心區(qū)域顯影。
　　2.熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)魚精蛋白陽離子納米泡可以有效攜載siRNA、質(zhì)粒、抗體,并能有效轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞、

10、原代細(xì)胞及干細(xì)胞。其中,載Cy3ARsiRNA的陽離子納米泡在鏡下發(fā)出紅色的熒光,部分呈“指環(huán)狀”;其最大基因攜載量約為(15-16)μg/108個(gè)納米泡;載ARsiRNA的陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照可以有效轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞,CCK-8生長曲線顯示,與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比,前者的細(xì)胞生長抑制率明顯高于脂質(zhì)體(P<0.05)。
　　3.載ARsiRNA的陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照可以抑制裸鼠AIPC移植瘤的生長,移植瘤的 AR蛋白及

11、 ARmRNA的表達(dá)水平明顯降低,同時(shí)接受治療后的移植瘤冰凍切片熒光顯微鏡結(jié)果顯示,Cy3ARsiRNA可以穿透血管進(jìn)入移植瘤組織;掃描電鏡發(fā)現(xiàn)無論是體外細(xì)胞還是移植瘤實(shí)體細(xì)胞,其細(xì)胞膜表面均有孔道形成。
　　結(jié)論:
　　1.魚精蛋白陽離子納米泡大小一致、分布均勻,表面帶有正電荷,穩(wěn)定性能好,具有良好的體外和體內(nèi)超聲造影效果。
　　2.魚精蛋白陽離子納米泡可以有效攜載不同的治療基因(siRNA、質(zhì)粒、抗體),體外實(shí)驗(yàn)中

12、聯(lián)合超聲輻照可以有效轉(zhuǎn)染多種不同細(xì)胞,針對(duì)AIPC細(xì)胞,載ARsiRNA的陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照能有效抑制AIPC細(xì)胞的生長。
　　3.載ARsiRNA陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照可以使AIPC移植瘤的AR蛋白質(zhì)及ARmRNA的表達(dá)受到抑制,從而達(dá)到有效抑制AIPC移植瘤生長的效果。超微形態(tài)學(xué)觀察證實(shí),載ARsiRNA陽離子納米泡聯(lián)合超聲輻照處理后,AIPC細(xì)胞及其移植瘤細(xì)胞膜上有明顯的孔道形成,表明載 ARsiRNA的陽離子納米泡