PLGA-CS雙層載藥陽(yáng)離子納米粒治療腦膠質(zhì)瘤的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是臨床發(fā)病率最高的腦腫瘤，是威脅人類健康的主要疾病之一，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)。由于腦膠質(zhì)瘤自身生長(zhǎng)具有浸潤(rùn)性以及血腦屏障(BBB)的存在，使得常規(guī)的治療方案包括手術(shù)切除、放療或化療均難以取得理想的治療效果。烷化劑類抗腫瘤藥物卡莫司?。–armustine，BCNU）通過(guò)將腫瘤細(xì)胞DNA鳥嘌呤上的第六位氧原子烷基化，促使DNA鏈間產(chǎn)生交聯(lián)，從而影響DNA復(fù)制。但是由于腫瘤細(xì)胞中存在DNA修復(fù)酶，尤其是O6-甲基鳥嘌呤-DN

2、A-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)，它可以將DNA鳥嘌呤上的烷基轉(zhuǎn)移到自身，修復(fù)腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)BCNU產(chǎn)生耐藥性。O6-芐基鳥嘌呤(O6-Benzylguanine，BG)，通過(guò)直接消耗細(xì)胞中MGMT，達(dá)到有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑耐藥性的作用。本課題以烷化劑BCNU為模型藥物、BG為抗腫瘤增敏劑，采用可生物降解的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和殼聚糖(

3、CS)為納米粒載體材料，制備核殼型雙層納米粒(PLGA/CS NPs)。以載有BCNU的PLGA為內(nèi)核，分散有BG的CS為外殼，通過(guò)外層BG的釋放，消耗腫瘤細(xì)胞中的MGMT，從而提高隨后釋出的BCNU抗腫瘤活性。
　　第一章的主要內(nèi)容是BCNU與其增敏劑BG的處方前研究。建立了BCNU與BG的HPLC分析方法;考察了BCNU在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，BCNU在水溶液中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在有機(jī)溶劑中，且隨著pH值的增大和溫度的升

4、高而降低。以MGMT水平較低的C6細(xì)胞、MGMT水平較高的F98細(xì)胞和人原代膠質(zhì)母細(xì)胞（臨床病理診斷Ⅳ級(jí)，HPG）為腫瘤細(xì)胞模型，考察BG對(duì)BCNU細(xì)胞毒性的增敏作用。結(jié)果表明，BG可以提高C6、F98和HPG細(xì)胞對(duì)BCNU的敏感性，其增敏程度與腫瘤細(xì)胞本身MGMT表達(dá)水平有關(guān)。此外，BG的給藥濃度和給藥時(shí)間均對(duì)其增敏作用有一定影響。
　　第二章為(BCNU+BG)-PLGA/CS雙層納米粒的制備和表征。首先以粒徑、Zeta電位和

5、BCNU載藥量為指標(biāo)進(jìn)行單因素考察，包括PLGA分子量、PLGA濃度、CS分子量、CS濃度、表面活性劑、超聲功率、油相/水相體積比和除去有機(jī)溶劑方式等。確定主要影響因素后，通過(guò)正交試驗(yàn)獲得優(yōu)化的處方和制備工藝。最優(yōu)處方制備得到(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒的粒徑為177.1±3.2 nm，Zeta電位為19.6±4.8 mV，BCNU載藥量為(3.05±0.32)％，BG載藥量為（8.97±0.81）％。(BCNU+BG)-P

6、LGA/CS納米粒的Zeta電位隨著溶劑pH值的增大而降低。透射電鏡和掃描電鏡結(jié)果顯示，制得的納米粒呈清晰的核-殼雙層結(jié)構(gòu)，形態(tài)較圓整，大小均一。
　　第三章對(duì)PLGA/CS雙層納米粒進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)。血漿中穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLGA/CS納米粒中BCNU的降解半衰期延長(zhǎng)至BCNU原藥的5倍。PLGA納米粒和PLGA/CS納米?？瞻纵d體的溶血毒性均較低。以C6、F98和HPG細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，考察載藥納米粒的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，載

7、藥納米粒組的細(xì)胞毒性均大于原藥組，其中同時(shí)載BCNU和BG的納米粒細(xì)胞毒性最強(qiáng)。在各給藥組中，F(xiàn)98細(xì)胞與HPG細(xì)胞不僅對(duì)BCNU具有相似的耐藥性，而且BG對(duì)兩種細(xì)胞的增敏效果也一致，因此選擇F98細(xì)胞作為耐藥腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，進(jìn)行下一步體內(nèi)外評(píng)價(jià)。制備載熒光探針（香豆素6）的納米粒并進(jìn)行表征，結(jié)果表明，載香豆素6的納米粒和載藥納米粒具有相近的粒徑和Zeta電位;此外，體外泄漏試驗(yàn)結(jié)果表明，納米粒中香豆素6在24 h的體外泄漏率低于2％

8、，證明香豆素6是一種較為理想的熒光探針，可用于示蹤納米粒的體內(nèi)外行為。采用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察F98細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取，結(jié)果表明，CS表面修飾可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取，而隨著納米粒粒徑的增大，攝取量降低，且細(xì)胞攝取呈時(shí)間依賴性。F98細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取機(jī)理研究結(jié)果表明PLGA/CS納米粒主要通過(guò)與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用，然后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和細(xì)胞膜穴樣凹陷內(nèi)吞入胞。
　　第四章考察了熒光探針標(biāo)記的PLGA/C

9、S雙層納米粒的體內(nèi)分布。香豆素6和BG載入PLGA/CS納米粒后在大鼠血漿中的滯留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，表現(xiàn)為AUC、t1/2β和MRT顯著增加。組織分布也發(fā)生顯著變化，特別是在腦組織，載入PLGA/CS納米粒后香豆素6和BG的AUC分別為對(duì)應(yīng)溶液組的2.38倍和2.44倍;在腫瘤部位的AUC則分別提高了2.21倍和2.80倍。以上結(jié)果表明PLGA/CS納米粒改變了藥物的體內(nèi)行為。
　　第五章以F98荷瘤大鼠為模型，對(duì)(BCNU+BG)-

10、PLGA/CS納米粒進(jìn)行藥效學(xué)和安全性評(píng)價(jià)。無(wú)論是游離藥物組還是納米粒組，BCNU聯(lián)合BG給藥后均能顯著延長(zhǎng)荷瘤大鼠的生存時(shí)間，其中納米粒組平均生存時(shí)間和中位生存期最長(zhǎng)，生存期延長(zhǎng)率最大。相應(yīng)地，通過(guò)MRI在體觀察各給藥組荷瘤大鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明各給藥組均能不同程度地抑制腫瘤生長(zhǎng)，其中(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒具有最強(qiáng)的抗腫瘤活性，該組荷瘤大鼠的平均腫瘤直徑最小。此外，通過(guò)體重測(cè)定和神經(jīng)學(xué)評(píng)分初步證明PLGA/CS

11、納米粒安全性較高。H&E染色和TUNEL法的結(jié)果表明，(BCNU+BG)-PLGA/CS納米粒組中腫瘤細(xì)胞對(duì)正常腦組織的浸潤(rùn)度顯著降低，腫瘤細(xì)胞的凋亡明顯增加。
　　本課題構(gòu)建了同時(shí)裝載BCNU與BG的陽(yáng)離子核殼型雙層納米粒(PLGA/CS NPs)，顯著延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，改善了藥物跨過(guò)BBB的能力，進(jìn)而提高了藥物在腫瘤部位的蓄積。同時(shí)，一系列體內(nèi)外研究結(jié)果證明載BCNU和BG的PLGA/CS納米粒可以明顯增強(qiáng)BCNU的