iRGD修飾的PLGA-CS雙層載藥納米粒的初步研究.pdf

1、抗腫瘤烷化劑卡莫司汀(1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU）是臨床上治療腦膠質(zhì)瘤最常使用的化療藥物之一，但其臨床應(yīng)用中容易產(chǎn)生耐藥性，這與腫瘤細(xì)胞中O6_甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltrans-ferase，MGMT)的修復(fù)作用有關(guān)，O6-芐基鳥(niǎo)嘌呤(O6-benzylguanine，BG)能直接消耗細(xì)胞中的MGMT逆轉(zhuǎn)其耐藥性。本課

2、題組前期研究中采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了PLGA/CS雙層載藥納米粒，內(nèi)外層分別包載BCNU和BG兩種藥物，與BCNU原藥相比，顯著延長(zhǎng)了藥物的體內(nèi)滯留時(shí)間，提高了跨血腦屏障(blood brain barrier, BBB)能力，增強(qiáng)了BCNU的抗腫瘤活性，但此納米粒遞藥系統(tǒng)中BG和BCNU先后釋藥行為不理想，靶向遞藥能力有待進(jìn)一步提高。
　　許多腫瘤細(xì)胞（包括腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞）以及其新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面都會(huì)高度表達(dá)αv.整合素，一種

3、名為“內(nèi)化RGD”(internalizing RGD，iRGD，CCRGDK/RGPDC)的環(huán)狀多肽，不僅與整合素具有較高的親和力，而且能夠通過(guò)腫瘤部位蛋白水解酶的作用，水解產(chǎn)生C端為RGDK/R序列的多肽片段，該多肽片段能進(jìn)一步通過(guò)1-型跨膜糖蛋白（neuropilin-1，NRP-1）內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。本課題擬制備一種iRGD修飾的主動(dòng)靶向雙層納米粒遞藥系統(tǒng)，改進(jìn)PLGA/CS雙層載藥納米粒的制備方法，并將目標(biāo)多肽連接在納米粒表面

4、，以期達(dá)到較高的抗腫瘤活性，并做更進(jìn)一步考察。
　　課題在已建立的BCNU和BG分析方法基礎(chǔ)上，考察兩種藥物在不同條件下的穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)BCNU的細(xì)胞毒性以及BG對(duì)原藥的增敏作用進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，溫度和pH對(duì)BCNU的穩(wěn)定性均有較大影響，在一定范圍內(nèi)降低溫度和pH能提高其穩(wěn)定性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，BG對(duì)C6、F98、U87三種腫瘤細(xì)胞均能起到顯著的增敏作用，程度與細(xì)胞中MGMT的表達(dá)水平有關(guān)。
　　本研究改用乳化溶劑分散

5、法(spontaneous emulsification solvent diffusionmethod，SESD)制備共載BCNU和BG的PLGA/CS納米粒，首先以粒徑、Zeta電位和BCNU的載藥量為指標(biāo)對(duì)PLGA分子量、PLGA濃度、PVA濃度和CS濃度等進(jìn)行單因素考察，進(jìn)而通過(guò)正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)處方。然后對(duì)納米粒中BCNU的穩(wěn)定性和體外釋放行為進(jìn)行考察，并與本課題組掌握的乳化溶劑揮發(fā)法(emulsion-solvent evap

6、oration method，ESEM)制備的納米粒相比較。結(jié)果顯示，最優(yōu)處方制得納米粒粒徑為121.6±3.3 nm，Zeta電位為32.3±4.1 mV，BCNU和BG的載藥量分別為1.86±0.17％和6.82±1.15％，與原處方接近。體外穩(wěn)定性研究顯示，原納米粒與本納米粒表觀(guān)一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)k的比值為1∶8，本納米粒顯著提高了BCNU的穩(wěn)定性。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，4h時(shí)BG的釋放量已接近100％，而B(niǎo)CNU24h時(shí)的累積釋放量

7、未超過(guò)65％，說(shuō)明BG能夠先于BCNU釋放，BCNU有良好的緩釋效果，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。
　　本研究采用雙功能基團(tuán)聚乙二醇(Maleimide-polyethyleneglycol-N-Hydroxysuccinimide，MAL-PEG-NHS，MW2000)為間隙基將iRGD修飾在納米粒表面。即先將PEG與CS共價(jià)連接，同法制備PLGA/CS-PEG納米粒(PEG-NPs)，然后通過(guò)iRGD與PEG一端的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)與納米粒連接

8、制得iRGD-PEG-NPs。BCA顯色反應(yīng)和X射線(xiàn)光電子能譜(XPS)分析均證明多肽成功連接在了納米粒表面。對(duì)納米粒進(jìn)一步表征結(jié)果顯示，PEG-NPs的粒徑、Zeta電位和載藥量分別為122.5±2.89 nm、32.7±6.66 mV和1.82±0.11％，與PLGA/CSNPs基本相同;而iRGD-PEG-NPs的粒徑、Zeta電位和載藥量分別為126.3±3.67nm、34.3±5.51 mV和1.50±0.04％，載藥量略低。

9、電鏡結(jié)果顯示，制得納米粒形態(tài)圓整，大小均一，具有核-殼型結(jié)構(gòu)。
　　分別對(duì)納米粒中BCNU在pH7.4 PBS和血漿中的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，BCNU、PEG-NPs和iRGD-PEG-NPs中BCNU在pH7.4緩沖液中表觀(guān)一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)k的比值為13.46∶1∶1.04，血漿中表觀(guān)一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)k的比值為18.39∶1∶1.13，表明納米粒在PBS和血漿中均能顯著提高BCNU的穩(wěn)定性。納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，PLGA/CS

10、 NPs、PEG-NPs和iRGD-PEG-NPs中BG在4h時(shí)的釋放量均接近100％，而B(niǎo)CNU在24 h時(shí)的累積釋放量均未超過(guò)68％，釋放行為基本相同。
　　以C6、F98和U87細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，采用MTT法考察載藥納米粒的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)顯示，與原藥相比，載藥納米粒的細(xì)胞毒性均顯著高于原藥組，聯(lián)合應(yīng)用BG后對(duì)三種細(xì)胞的毒性分別提高了2.3、4.0和1.7倍左右，顯示了不同程度的增敏作用，iRGD多肽的修飾進(jìn)一步提高了

11、細(xì)胞毒性。采用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別對(duì)納米粒的攝取行為進(jìn)行了定性和定量考察。結(jié)果顯示，細(xì)胞攝取量隨納米粒濃度的增大而增大，連接多肽能顯著提高納米粒向腫瘤細(xì)胞的內(nèi)化攝取能力。進(jìn)一步，以腫瘤球?yàn)槟Ｐ腕w外考察納米粒滲透腫瘤的能力，結(jié)果顯示，多肽修飾納米粒的滲透腫瘤的能力顯著優(yōu)于普通納米粒。
　　本課題構(gòu)建了iRGD修飾的共載BCNU和BG兩種藥物的核-殼型納米粒。BG能夠先于BCNU釋放，BCNU具有良好的緩釋效果，納米粒顯著提