新型修飾載基因固體脂質(zhì)納米粒的研究.pdf

1、基因治療為治療惡性腫瘤、遺傳病、病毒性流行病等諸多疾病提供了新的解決途徑,因此成為當(dāng)代醫(yī)藥學(xué)和生物學(xué)研究的熱點,并且正在逐步變成現(xiàn)實?；蛑委煹闹饕康氖浅晒Φ膶⑦z傳物質(zhì)傳遞到目標(biāo)組織、器官或者細(xì)胞。裸露的治療基因容易被核酸酶降解,表達(dá)時效短,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率很低。因此構(gòu)建安全高效的基因載體就成為基因治療領(lǐng)域的一個重要的研究方向。基因載體可分為病毒載體和非病毒載體。和病毒載體相比,非病毒載體具有低免疫原性、易規(guī)?；a(chǎn)、劑型設(shè)計靈活、可根據(jù)

2、基因的大小和形狀進行裝配等諸多優(yōu)勢。非病毒載體中的脂質(zhì)類載體近年來被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因傳遞系統(tǒng)。本課題組在脂質(zhì)類載體方面做了一些研究,包括脂質(zhì)體、陽離子固體脂質(zhì)納米粒、陰離子固體脂質(zhì)納米粒等。在這些脂質(zhì)類載體中,我們主要集中于研究陽離子固體脂質(zhì)納米粒,如何降低其毒性,提高其主動靶向性能,從而提高轉(zhuǎn)染效率,是亟待我們探索的問題。對納米載體進行修飾,可以降低毒性、提高靶向性,因此成為納米給藥系統(tǒng)的研究熱點。
　　 本文采用單硬脂酸甘

3、油酯和卵磷脂為脂質(zhì)材料,增強型綠色熒光蛋白基因(pEGFP)為報告基因,制備了陽離子載基因固體脂質(zhì)納米粒。為降低納米粒的毒性,設(shè)計合成新材料十二烷酸6-(2,6-二氨基-己酰氧基)己酯(LHLN)作為表面活性劑,制備新材料修飾的固體脂質(zhì)納米粒；為提高納米粒的主動靶向性,設(shè)計合成靶向因子甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物(Mannan-PE),對SLN進行表面修飾。課題主要研究方法和結(jié)果如下:
　　 1.新型陽離子類脂的合成和性質(zhì)

4、評價
　　 陽離子固體脂質(zhì)納米粒可通過過靜電吸附有效的結(jié)合DNA,從而介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染。然而毒性問題仍然不可忽視,并和所使用的陽離子表面活性劑的性質(zhì)有很大的關(guān)系。本課題設(shè)計并成功合成了一種單鏈的陽離子類脂LHLN,該類脂以賴氨酸作為陽離子首基團,月桂酸作為疏水尾部,己二醇作為連接物。LHLN的臨界膠束濃度(CMC)為0.11mmol·L-1,表面活性較高。使用其作為陽離子表面活性劑,采用納米沉淀法(溶劑擴散法)制備了新型陽離子固體脂

5、質(zhì)納米粒。與常用的陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)制備的固體脂質(zhì)納米粒相比,LHLN修飾的陽離子固體脂質(zhì)納米粒表面光滑,粒徑較小(52.6±6.5 nm),粒度分布較窄(0.12±0.03)。相比于使用CTAB制備的納米復(fù)合物和商品化陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000,新型的納米復(fù)合物毒性較低(p<0.05)。因此,該類脂表面活性高,毒性較低,有望推廣應(yīng)用于多種陽離子脂質(zhì)類載體的構(gòu)建。
　　 2.新材

6、料LHLN修飾的載基因固體脂質(zhì)納米粒
　　 在成功構(gòu)建新材料修飾的陽離子固體脂質(zhì)納米粒后,本部分進一步結(jié)合增強型綠色熒光蛋白基因(pEGFP),制備了新型載基因固體脂質(zhì)納米粒。LHLN修飾的載基因固體脂質(zhì)納米粒(LHLN-SLN-DNA)較為圓整,粒徑較小(75.8±9.3nm),粒度分布較窄(0.15±0.02),DNA吸附率較高(90.36％)。LHLN-SLN-DNA還具備良好的抗核酸酶降解的能力和較高的體外血漿穩(wěn)定性。該

7、基因載體系統(tǒng)在A549和HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率高于CTAB組(p<0.05),與載基因陽離子脂質(zhì)體Lipofectamin組效果相當(dāng)。結(jié)果表明新材料LHLN修飾的陽離子載基因質(zhì)納米?？梢赃_(dá)到有效的體外基因轉(zhuǎn)染效果,是一種較有前景的非病毒納米基因傳遞系統(tǒng)。
　　 3.甘露聚糖修飾的主動靶向載基因固體脂質(zhì)納米粒
　　 本文在前兩部分設(shè)計合成了單鏈陽離子類脂LHLN,并用于制備載基因陽離子固體脂質(zhì)納米粒,取得了相對較低的毒性

8、和較高的轉(zhuǎn)染效率。然而這種給藥系統(tǒng)仍然不具備主動靶向特定細(xì)胞的能力。因此我們決定使用配體對其進行進一步的表面修飾以達(dá)到受體-配體介導(dǎo)的主動靶向的目的。研究發(fā)現(xiàn),甘露糖殘基具有靶向肺泡巨噬細(xì)胞的能力,而和單糖相比多糖的糖類殘基數(shù)量更多,更能有效的介導(dǎo)細(xì)胞識別和攝取,因此我們選用甘露聚糖作為配體的主體。據(jù)文獻(xiàn)報道含有脂類的糖類衍生物易于摻和進入納米載體的表面,因此我們選擇磷脂酰乙醇胺作為親脂的錨定物。本部分設(shè)計合成了一種含有甘露聚糖的配體-

9、甘露聚糖的磷脂酰乙醇胺接枝聚合物,將其用于載基因固體脂質(zhì)納米粒的表面修飾,制備了甘露聚糖修飾的載基因固體脂質(zhì)納米粒(Man-SLN-DNA)。Man-SLN-DNA呈光滑的球形,粒徑為125.7±7.5nm,Zeta電位為4.37±1.09 mV,基因結(jié)合率為(91.5±1.9)％,體外毒性和轉(zhuǎn)染實驗采用鼠類巨噬細(xì)胞系RAW264.7進行評價；體內(nèi)實驗采用將修飾納米粒給藥進入大鼠肺部的方式,分離其肺泡巨噬細(xì)胞,觀測熒光評價轉(zhuǎn)染效果。和未