載基因固體脂質納米粒的研究.pdf

1、本文以硬脂酸(或AT0888)和卵磷脂為脂質材料，以增強型綠色熒光蛋白基因(pEGFP)作為報告基因，采用不同的工藝和組裝技術制備出三種不同的載基因固體脂質納米粒。其一是：陽離子固體脂質納米粒/pDNA二元復合物；其二是：陰離子型載魚精蛋白-pDNA復合物固體脂質納米粒；其三是：陰離子型載pDNA固體脂質三元復合納米粒。課題主要研究方法與結果如下： 1.模型基因的選擇和制備本研究中我們利用微生物發(fā)酵的方法大量培養(yǎng)轉化有質粒的大腸

2、桿菌，并采用柱層析的方法分離純化質粒。紫外分光光度法對質粒的純度和含量進行了測定，凝膠電泳法對質粒的單酶切結果進行了鑒定，結果顯示質粒純度符合要求。 2.陽離子固體脂質納米粒/pDNA二元復合物的研究本研究中我們制備陽離子固體脂質納米粒替代傳統(tǒng)的陽離子脂質體，以克服后者穩(wěn)定性不佳的問題。文中以CTAB為表面活性劑采用復乳法制備空白陽離子固體脂質納米粒，與報告基因復合，加入不同濃度Ca2+調節(jié)體系的荷正電量。最終得到的SLNs-p

3、DNA二元復合物的平均粒徑為(91.6±5.3)nm，粒徑分布均勻，細胞平均存活率相對于陰性對照組均在80％到110％之間，在生理酶濃度條件下，載體具有較好的保護pDNA抗核酸酶降解的能力。體外釋放實驗結果顯示，SLNs-pDNA二元復合物釋藥符合Weibull模型：lnln[1/(100-R/100)]=-0.44821nt+0.1329，r=0.9926。據(jù)此可以預計，DNA在陽離子固體脂質納米粒的保護下，能夠維持較長的作用時間。體

4、外轉染實驗結果表明，與裸露DNA相比，SLNs-pDNA在COS-7中的轉染效果顯著提高。在24h時復合物的轉染能力較陽離子脂質體Lipofectamine低，到48h時細胞中的綠色熒光強度明顯增強，蛋白表達率顯著提高較Lipofectamine組有所加強。 3.陰離子型載魚精蛋白-pDNA復合物固體脂質納米粒的研究鑒于陽離子型基因載體存在血液循環(huán)中穩(wěn)定性差及給藥途徑單一等不足之處，我們考慮制備適合全身給藥的陰離子型固體脂質納米

5、粒。文中采用陽離子聚合物--魚精蛋白縮合pDNA形成致密復合物，提高裸pDNA的穩(wěn)定性，進而將該復合物利用脂質材料進行包裹。其體外抗剪切實驗，抗酶解實驗和釋放實驗結果都能夠與實驗設計的初衷相吻合。本文中對陰離子型固體脂質納米粒作為基因載體的研究是一個全新的嘗試，在制備包封型固體脂質納米粒時發(fā)現(xiàn)，最終產(chǎn)品的粒徑較大，包封率為(86.5±5.28)％，粒徑為(627±22.9)nm；控制粒徑則不能夠得到理想的包封率，粒徑為(231±13.7

6、)nm時，包封率僅為(41.5±3.62)％，從而不能達到進行細胞轉染實驗的要求，為此我們試圖通過靜電吸附的方法組裝新型的載基因納米粒，從而彌補包封型固體脂質納米粒的不足。 4.陰離子型載pDNA固體脂質三元復合納米粒的研究在包封型載pDNA固體脂質納米粒的研究結果不盡如人意的同時，本文采用固體脂質三元復合納米粒的全新思路對陰離子型載基因固體脂質納米粒的研究予以補充和完善。采用薄膜分散．超聲法制備出平均粒徑為(19.2±5.5)

7、nm的陰離子型空白固體脂質納米粒，在靜電作用下將其自組裝到平均粒徑為(165±28.1)nm的正電性魚精蛋白-pDNA二元復合物表面，最終形成平均粒徑為(257.7±10.6)nm，zeta電位為(-17.16±1.92)mV的三元復合納米粒，其結合率達到(96.75±1.13)％。TEM和CD實驗結果均驗證了三元復合納米粒的形成。體外抗酶解實驗結果顯示，二元復合物和三元復合納米粒中完整DNA的回收率分別為60％和85％，降解率具有顯著

8、性差異(p<0.05)。體外釋放實驗在PBS中進行，三元復合納米粒的釋放過程符合Ritger-Peppas方程：lnR=0.6038 lnt+1.5292(r=0.9942)，有明顯的體外緩釋能力。與二元復合物相比，48h內(nèi)三元復合納米粒的細胞成活率較前者高(P<0.05)，并且明顯低于陽性對照(Lipofectamine組)的細胞毒性。體外基因轉染結果顯示，48h的轉染量接近Lipofectamine組，高于二元復合物組。 綜