載基因殼聚糖納米粒的初步研究.pdf

1、載基因殼聚糖納米粒的初步研究本研究選用殼聚糖為載體材料，以pORF-lacZ為模型基因，研制了載基因殼聚糖納米粒，對其制備工藝，理化性質(zhì)、載藥機(jī)理、體外基因傳輸性能及生物安全性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 采用單凝聚法制備了殼聚糖空白納米粒。以單因素法考察了殼聚糖濃度、三聚磷酸鈉濃度，反應(yīng)溫度，介質(zhì)pH值對平均粒徑的影響。較優(yōu)因素水平下制備的空白殼聚糖納米粒的平均粒徑為136.5±26.41nm，PDI為0.152。粒度分布均勻，粒徑

2、大部份集中于90～160nm間，透射電鏡觀察表明納米粒形態(tài)多呈球形。 采用復(fù)凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒。在制備空白殼聚糖納米粒的基礎(chǔ)上，以強(qiáng)度平均粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo)分別考察了殼聚糖濃度，三聚磷酸鈉濃度、質(zhì)?；驖舛鹊纫蛩貙Ω骺疾熘笜?biāo)的影響。結(jié)果表明殼聚糖濃度和質(zhì)?；驖舛葘χ苽涔に囉绊戯@著。因此，將殼聚糖濃度X1和基因濃度X2作為考察因素，采用中心組合設(shè)計(jì)和效應(yīng)面法對制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化指標(biāo)選擇強(qiáng)度平均徑、多分散度

3、(PDI)、Zeta電位、包封率、載藥量和總評歸一值(OD)，采用兩因素五水平的中心組合設(shè)計(jì)和效應(yīng)面法對制備條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了制備較佳條件[X1(Cs)=400ug/ml，X2(DNA)=110ug/m1]。預(yù)測值與實(shí)測值的偏差分別為1.89％，-4.22％，-6.34％，0.24％，-1.8％，-1.65％，表明建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性。較優(yōu)條件下制備三批納米粒樣品各優(yōu)化指標(biāo)測定結(jié)果的RSD值分別為1.18％，4.79％，2.

4、41％,1.70％，2.80％，0.54％，表明優(yōu)選制備工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。 形態(tài)及表面性質(zhì)評價結(jié)果表明載基因殼聚糖納米粒的形態(tài)比較規(guī)則，大多呈球形；平均粒徑較小(約200nm)且分布較為均勻(PDI≤0.2)。Zeta電位測定結(jié)果表明基因殼聚糖納米粒表面帶有一定強(qiáng)度的正電荷(約25mV)。藥物狀態(tài)與含量評價結(jié)果表明殼聚糖與質(zhì)粒DNA間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，三批供試品包封率均大于90％，載藥量均大于50％。體外穩(wěn)定性評價結(jié)果表明

5、，質(zhì)粒DNA在各種工藝拆分條件下均較為穩(wěn)定，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)未遭破壞；載基因殼聚糖納米粒能夠長時間(4h)有效保護(hù)質(zhì)粒DNA不被高濃度的DNA酶降解；小牛血清對其穩(wěn)定性具有濃度依賴性的明顯影響；常規(guī)儲存條件(室溫或4℃)下，24小時內(nèi)即可發(fā)生較為明顯的聚集。載藥機(jī)理初步研究結(jié)果表明：殼聚糖分子與質(zhì)粒DNA間通過非特異性的靜電結(jié)合形成殼聚糖-質(zhì)粒DNA復(fù)合物，在STPP的脫水作用下發(fā)生急劇聚集，將質(zhì)粒DNA包裹形成粒度約200nm的納米

6、粒；同時，未與質(zhì)粒DNA靜電結(jié)合的游離殼聚糖分子間通過相互間的聚集而將質(zhì)粒DNA包裹。極少數(shù)未被包裹的質(zhì)粒DNA則可通過非特異性的靜電作用吸附于納米粒表面。 制備了載基因殼聚糖納米粒的凍干品。凍干保護(hù)劑篩選結(jié)果表明最佳凍干保護(hù)劑為5％～10％的乳糖。采用冷凍干燥技術(shù)可以將其穩(wěn)定貯存期提高至3個月。 選用LoVo細(xì)胞(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)評價了體外基因傳輸性能。轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞經(jīng)X-gal染色后部份細(xì)胞呈藍(lán)色，陰性對照即裸質(zhì)

7、粒組沒有觀測到表達(dá)產(chǎn)物，證明采用殼聚糖為載體制備載基因納米粒傳遞外源性質(zhì)粒DNA具有可行性。隨著殼聚糖納米粒與LoVo細(xì)胞間作用時間的增加，轉(zhuǎn)染率呈現(xiàn)先增加，再逐漸降低的趨勢，較佳的相互作用時間應(yīng)為3～6h。體外轉(zhuǎn)染效率隨劑量增加呈上升趨勢，具有劑量依賴性。 通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法、細(xì)胞集落形成試驗(yàn)和溶血性試驗(yàn)對自制載基因殼聚糖納米粒的初步體外安全性評價結(jié)果表明載基因殼聚糖納米粒在各試驗(yàn)濃度均無細(xì)胞毒性，對單個細(xì)胞增