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文檔簡介
1、腦膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的較為常見的腫瘤,占腦部原發(fā)性腫瘤的32%。手術(shù)、放療和化療對腦膠質(zhì)瘤均沒有理想的治療效果。siRNA療法的發(fā)展為腦膠質(zhì)瘤的基因干預(yù)治療提供了新的方法。然而,siRNA在血液中容易被酶降解,而且siRNA不能通過血腦屏障,很難自主地在腦膠質(zhì)瘤富集。因此,構(gòu)建合適的siRNA遞藥系統(tǒng),使siRNA在腦膠質(zhì)瘤有效富集是siRNA治療腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。
目的:
本研究擬構(gòu)建一種 Fe3O4磁性
2、納米遞藥系統(tǒng),并在其表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-聚賴氨酸連接物,用于以polo樣激酶I為靶標(biāo)的小干擾RNA(siPLK1)的腦內(nèi)遞送,使siPLK1在血液循環(huán)中不被RNA酶降解,順利穿過血腦屏障,并在腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)有效蓄積,發(fā)揮抗腫瘤活性。
方法:
?。?)以轉(zhuǎn)鐵蛋白、聚乙二醇、L-賴氨酸為原料,合成轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-聚賴氨酸連接物(Tf-PEG-PLL),并對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。
?。?)采用化學(xué)共沉淀法制備表
3、面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-聚賴氨酸連接物的磁性納米粒Tf-PEG-PLL/MNP,與siPLK1復(fù)合,用納米粒度及zeta電位分析儀和場發(fā)射掃描電鏡對納米粒的粒徑、zeta電位和形態(tài)等進行表征。通過凝膠阻滯實驗,考察Tf-PEG-PLL/MNP納米粒與siPLK1的復(fù)合效率,并考察RNA酶對復(fù)合在Tf-PEG-PLL/MNP納米粒中的siPLK1的降解作用。
(3)采用MTT實驗考察Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納
4、米粒對U87細胞的細胞毒性;通過Western Blot檢測Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒對目標(biāo)基因PLK1表達的沉默效應(yīng)。采用Western Blot檢測Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒對U87細胞中凋亡相關(guān)蛋白p53、NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響,探討Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒誘導(dǎo)U87細胞凋亡的機制。
?。?)通過激光共聚焦顯微鏡和流式
5、細胞儀檢測 U87細胞對 Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒的攝取,以及轉(zhuǎn)運siPLK1在U87細胞內(nèi)的分布情況,并對U87細胞攝取Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒的機制進行研究。
(5)采用流式細胞儀檢測 Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒對 U87細胞細胞周期的影響;采用Western Blot檢測U87細胞中周期相關(guān)蛋白wee1、CDK1、Cyclin B1表達的變化。
6、 (6)建立體外轉(zhuǎn)胞吞細胞模型,通過激光共聚焦顯微鏡觀察 Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒穿過HUVEC細胞單層膜的能力。
?。?)利用U87細胞建立體外三維腦膠質(zhì)瘤模型,通過激光共聚焦顯微鏡觀察Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒轉(zhuǎn)運siPLK1在體外三維腦膠質(zhì)瘤中的分布;并通過光學(xué)顯微鏡和場發(fā)射掃描電鏡觀察Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒對體外三維腦膠質(zhì)瘤生長的抑制作用。
7、 ?。?)采用活體成像儀觀察Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒在小鼠腦部的分布,建立荷U87細胞腦膠質(zhì)瘤小鼠模型,觀察Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒的體內(nèi)抗腫瘤活性。
結(jié)果:
?。?)Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒的粒徑為54 nm,zeta電位為+11mV,形態(tài)為球形。
?。?)凝膠阻滯實驗結(jié)果表明:當(dāng)siPLK1與Tf-PEG-PLL/MNP納米粒的質(zhì)量比為
8、1:5時,兩者完全復(fù)合并有效保護siPLK1不被RNA酶降解。
?。?)體外細胞毒性結(jié)果表明:Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能有效抑制U87細胞的增殖,且效果優(yōu)于Lipofectamine2000@siPLK1;Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能抑制目標(biāo)基因PLK1的表達;Western Blot結(jié)果顯示Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能顯著增加Caspase-3、p53、Bax
9、的表達,下調(diào)NF-κB、Bcl-2的表達,促進細胞凋亡。
?。?)激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:在納米粒表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白能增加 U87細胞對 Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒的攝??;Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒通過網(wǎng)格蛋白及小窩蛋白介導(dǎo)進入 U87細胞;Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能有效轉(zhuǎn)運siPLK1至細胞漿。
(5)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示 Tf-P
10、EG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能使 U87細胞阻滯于G2期;Western Blot結(jié)果顯示Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能增加U87細胞wee1蛋白的表達,降低CDK1和Cyclin B1的表達。以上結(jié)果表明:Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能夠通過增加wee1蛋白的表達,降低CDK1和Cyclin B1的表達,從而抑制G2/M期轉(zhuǎn)化,使U87細胞阻滯于G2期。
(6)體外轉(zhuǎn)胞吞實
11、驗結(jié)果表明,Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒在轉(zhuǎn)鐵蛋白和外加磁場的作用下,能夠通過HUVEC細胞單層膜,在U87細胞中蓄積。
(7)U87細胞體外三維腦膠質(zhì)瘤模型實驗結(jié)果顯示,Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒可將siPLK1轉(zhuǎn)運到U87細胞體外三維腦膠質(zhì)瘤的內(nèi)部,抑制體外三維腦膠質(zhì)瘤的生長。
?。?)體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果表明, Tf-PEG-PLL/MNP@siPLK1納米粒能夠?qū)iPL
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