基于超順磁性四氧化三鐵磁性納米顆粒的惡性膠質瘤靶向聯(lián)合基因治療.pdf

1、第一章 目的：制備能夠應用于膠質瘤靶向聯(lián)合基因治療的四氧化三鐵磁性納米顆粒，建立以超順磁性Fe3O4磁性納米顆粒為基因載體的膠質瘤基因治療基因轉運體系，并評價該體系的體外基因轉運效率。 方法：以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮鐵為原料，采用高溫分解鐵有機物法是將鐵前驅體高溫分解得到鐵原子，再由鐵原子生成鐵納米顆粒，將鐵納米顆粒控制氧化得到四氧化三鐵納米顆粒；再以偶聯(lián)劑γ-氨丙基三乙氧基硅烷(NH2C3H6Si(OC2H5)3)對F

2、e3O4磁性納米顆粒(Fe3O4 magnetic nanoparticle，F(xiàn)e3O4 MNP)表面修飾；將CD基因轉染U251膠質瘤細胞，得到U251-CD細胞，免疫熒光染色檢測本體系的轉染效率。通過Fe3O4MNP與質粒pCMVCD結合試驗，F(xiàn)e3O4MNP-pCMVCD復合物的DNase-I消化，血清消化保護實驗結果檢測Fe3O4 MNP結合DNA的能力及對DNA的保護效果。采用RT-PCR、Westem blotting，和高

3、效液相色譜法等檢測CD基因的mRNA水平和CD蛋白水平，U251-CD細胞。MTT法測定檢測U251-CD細胞的5-FC化療效果及旁觀者效應。 結果：制備出穩(wěn)定性好、單分散、粒徑小、粒徑分布范圍窄(10±2nm)的磁性Fe3O4/氨基硅烷復合納米顆粒，以γ-氨丙基三乙氧基硅烷作分散穩(wěn)定劑，改善了磁性Fe3O4納米顆粒表面的疏水環(huán)境，有效地阻止了四氧化三鐵納米顆粒團聚的發(fā)生。當Fe3O4MNP與質粒pCMVCD質量比為0.05：1

4、時，結合的質粒量<20％；當二者質量比為1：1時，幾乎可以結合體系中的全部質粒。Fe3O4MNP-pCMVCD復合物能夠保護質粒pCMVCD免受Dnase-I及血清的消化作用，保持其結構穩(wěn)定。使用Fe3O4ⅣrNP作為載體成功將CD基因成功轉染U251細胞，轉染細胞有CD基因穩(wěn)定表達，呈時間相關性增強表達模式(轉染后5天內呈現(xiàn)表達持續(xù)增加模式)，轉染效果明顯優(yōu)于脂質體轉染對照組。Fe3O4 MNP的轉染效果與Fe3O4 MNP的用量呈正

5、相關，且無明顯的細胞毒性，經MTT檢測Fe3O4 MNP在50mg/L以下時不影響U251細胞的生長曲線。U251-CD細胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后，細胞培養(yǎng)液上清中，經高效液相色譜檢測出U251-CD細胞生成的高濃度5-氟尿嘧啶。能顯著的抑制U251細胞生長。U251與U251-CD混合細胞中，在加入5-FC(終濃度1000uml/L)后，10％的U251-CD細胞可以殺滅20~30％的U251與U251-CD混合細胞與對照組(

6、O％組)相比P<0.01，15％的U251-CD細胞可以殺滅約50％U251與U251-CD的混合細胞；30％的U251-CD細胞可以殺滅約80％U251與U251-CD的混合細胞：50％以上的U251-CD細胞可以完全的殺滅U251與U251-CD的混合細胞。 結論：制備的經γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的Fe3O4磁性納米顆粒粒徑小，生物相容性提高，達到作為基因載體應用于膠質瘤靶向聯(lián)合基因治療要求。超順磁性Fe3O4納米顆粒基因

7、轉運體系在體外U251膠質瘤細胞系應用中轉染效果顯著。Fe3O4MNP/CD/5-FC膠質瘤基因治療系統(tǒng)應用于膠瘤基因治療體外試驗抑瘤效果突出，可應用于下一步動物體內實驗檢測。 第二章 目的:在第一章的Fe3O4MNP/CD/5-FC膠質瘤基因治療系統(tǒng)成功研發(fā)的基礎上，為優(yōu)化該基因治療系統(tǒng)，研發(fā)wt-p53、wt-p16基因聯(lián)合胞嘧啶脫氨酶( Cytosine Deaminase，CD)/5-FC系統(tǒng)治療神經膠質瘤的可行

8、性，以期能提高膠質瘤化療效果及逆轉膠質瘤干細胞對化療藥物產生多藥耐藥性。 方法:分離培養(yǎng)并鑒定U251細胞系及30例臨床膠質瘤病理標本(WHOⅢ級、IV級)的膠質膠干細胞。利用Fe3O4MNP為基因載體分別將質粒pCDNA3.1-p16、pYD5-p53，及pCMVCD轉染至U251細胞、各組病理組織分離的膠質瘤細胞及其膠質瘤干細胞(Glioma stemcells，GSC)。采用RT-PCR、Western blotting檢

9、測目標基因轉染后在相應的細胞中的表達情況。MTT法檢測不同基因治療方案的U251細胞及U251GSC細胞的對CD/5-FC的治療敏感性；并檢測四種臨床常用化療藥物VM-26，VP-16，TMZ，5-FU對不同基因治療方案的U251及U251GSC的生長抑制率。使用AnnexinV-PI雙染法對10例病理標本分離出來的并經轉染后的各組Ⅲ～IV級膠質瘤細胞實施不同的基因治療方案后的細胞凋亡情況進行檢測。 結果:成功以Fe3O4 MN

10、P為載體將wt-p53、wt-p16，及CD基因轉染U251細胞、30例病理標本分離出來膠質瘤細胞，及其膠質瘤干細胞，并穩(wěn)定表達。RT-PCR、Western blotting檢測結果顯示膠質瘤細胞和膠質瘤干細胞的目標基因表達情況無差別(p<0.01)。體外轉染wt-p53、wt-p16基因都能明顯提高CD/5-FC人對U251細胞系的化療效果。以VM-26、VP16、TMZ，5-FU的1倍血漿峰濃度值的細胞增殖抑制率，各化療藥物組對U

11、251膠質瘤細胞的體外增殖均有不同程度的抑制，以TMZ效果最好；但U251GCS對各種化療敏感度均較U251細胞明顯下降(p<0.01)，其中TMZ效果最好；P53/P16轉染組U251GCS對VM-26、VP16、TMZ，5-FU的敏感性較U251GCS均明顯提高(p<0.01)，TMZ效果仍是最好。對10例病理標本分離出來的并經轉染后的各組Ⅲ～IV級膠質干瘤細胞實施不同的基因治療方案后的細胞凋亡情況進行檢測結果顯示CD/P53/P1

12、6聯(lián)合組膠質干瘤細胞凋亡率(46.32±12.78％)高于對照組(1.53±1.22％)及P53(30.1±10.45％)、P16(33.10±9.89％)單獨轉染組(p<0.01)。CD/P53/P16/5-FC組(89.87±9.02％)明顯高于CD/P53/P16/5-FU組(60.18±6.23％)(p<0.01)。 結論:基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系可作為臨床上膠質瘤

13、治療方案的一種可能選擇，可在體外有效的殺滅膠質瘤細胞及膠質瘤干細胞，該基因治療系統(tǒng)對腫瘤細胞殺傷作用的機理與凋亡相關。另外，該體系能逆轉膠質瘤干細胞對多種臨床常用的化療藥物的耐藥性，明顯提高化療效果。 第三章 Fe3O4 MNP介導CD/5-FC系統(tǒng)聯(lián)合wt-p53及wt-p16治療惡性膠質瘤的動物實驗研究 目的：Fe3O4磁性納米基因載體在體內的轉染效果及靜脈注射時體內分布情況。在膠質瘤干細胞裸鼠皮下成瘤動物模型中驗證

14、本課題研發(fā)的“基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系”的治療效果。實施體內磁靶向定位基因治療，并觀察該基因治療體系的全身副作用。 方法：建立膠質瘤干細胞皮下荷瘤裸鼠模型。原子吸收分光光度計檢測Fe3O4MNP在裸鼠體內的磁靶向定位效果及體內分布情況。免疫組化檢測各目標基因的蛋白在動物模型膠質瘤組織中的表達，并采用TUNEL原位凋亡試劑盒檢測各組腫瘤組織細胞凋亡情況。效液相色譜法檢測5-F

15、C體內轉化為5-FU情況。體內抑瘤實驗檢測不同基因治療方案下各組膠質瘤干細胞在裸鼠皮下成瘤體積，計算抑瘤率，評定治療效果，并觀察裸鼠體重的變化。對比CD/P53/P16轉染組5-FC與5-FU的治療效果及全向副作用。 結果：成功建立膠質瘤干細胞皮下荷瘤裸鼠模型，一般在接種后14d可見較明顯皮下結節(jié)的形成。在體外腫瘤表面施加4000高斯磁場時，鼠尾靜脈注射磁性納米顆粒溶液后45min，實驗組的腫瘤組織鐵元素含量(μg/g)為91.

16、46±19.94，遠高于對照組30.23±6.34，(p<0.01)。說明在磁場作用下Fe3O4MNP定向向腫瘤組織移動，大量聚集在腫瘤組織內造成鐵元素含量明顯升高，另外腦組織鐵含量也較正常對照組明顯升高p<0.01>，說明Fe3O4MNP透過血腦屏障能力顯著。wt-p53、wt-p16能夠顯著的裸鼠荷瘤的體積，并減少荷瘤裸鼠體重的下降。荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FC后Sd起皮下腫瘤體積明顯縮小，經高效液相色

17、譜對腫瘤組織均漿檢測出5-FU。而荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FU后1M內腫瘤體積未見縮小，反而進行性惡化。5-FC治療組對裸鼠骨髓抑制、血常規(guī)、肝功能影響明顯小于5-FU治療組(p<0.01)。各組荷瘤裸鼠TUNEL檢測凋亡情況結果與第二章體外檢測結果一致。對12例不同的膠質瘤病理組織分離培養(yǎng)的膠質瘤干細胞裸鼠皮下形成的膠質瘤行體內Fe3O4MNP介導的CD/p53/p16基因治療。12例中原病理組織P53，

18、P16免疫組化陽性率均為25％，基因治療總有效率為33070(4/12)，微效率為25％(3/12)，無效率為25％(3/12)，惡化率為17％(1/12)。 結論：基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系可作為臨床上膠質瘤治療方案的一種可能選擇，可在膠質瘤干細胞皮下荷瘤裸鼠模型體內有效抑制膠質瘤生長，在5-FC治療時能有效的縮小己生成膠質瘤體積，該基因治療系統(tǒng)對腫瘤細胞殺傷作用的機理與凋