Angiopep-2、IP10-EGFRvⅢscFv融合蛋白修飾納米顆粒聯(lián)合CTL治療惡性膠質(zhì)瘤研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：IP10-EGFRvⅢscFv融合蛋白的構(gòu)建和制備
　　目的：通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞因子融合蛋白IP10-EGFRvⅢscFv，并完成融合蛋白的大量擴(kuò)增、純化與復(fù)性。
　　方法：基因工程技術(shù)構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒GV219IP10-EGFRvⅢscFv，兩段目的基因依次克隆于重組質(zhì)粒GV219PCMV啟動(dòng)子的下游，二者以編碼(Gly4Ser)3的柔性接頭序列（linker）相連。

2、利用限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因IP10-scFv從真核表達(dá)載體上酶切下來(lái)，加入到高效原核表達(dá)載體PET30a的T7啟動(dòng)子下游，在IPTG的誘導(dǎo)下高效表達(dá)融合蛋白，通過(guò)His6-tag標(biāo)簽鎳磁珠純化蛋白后進(jìn)行透析復(fù)性。并在透析緩沖液中加入GSSG/GSH氧化還原體系，促進(jìn)變性融合蛋白的復(fù)性。以銀染檢測(cè)融合蛋白的純度，western-blotting分析融合蛋白。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒GV219IP10-EGFRvⅢs

3、cFv，通過(guò)PET高效原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得大量的融合蛋白（包涵體表達(dá)），鎳磁珠連續(xù)分選獲得純度>95％的融合蛋白，銀染和western-blotting檢測(cè)融合蛋白的分子量為46kDa。
　　第二部分：Angiopep-2、IP10-EGFRvⅢscFv融合蛋白表面修飾納米顆粒的制備及腦穿越實(shí)驗(yàn)
　　目的：通過(guò)納米技術(shù)制備Angiopep-2、IP10-EGFRvⅢscFv表面修飾納米顆粒，并完成納米顆粒穿越血腦屏障的體內(nèi)、體

4、外研究。
　　方法：使用生物納米材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)和PLGA-PEG-Mal制備高分子多聚體納米顆粒，同時(shí)以Angiopep-2和/或IP10-scFv修飾納米粒表面，分別制備出實(shí)驗(yàn)組AINPs、對(duì)照組ANPs、INPs和NPs。以香豆素-6和若丹明B（RhoB）作為熒光探針，對(duì)AINPs的腦內(nèi)遞藥特性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。以香豆素-6標(biāo)記的熒光納米粒，經(jīng)尾靜

5、脈注射BABL/C/Nudenu，通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)對(duì)AINPs的腦內(nèi)遞藥特性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。以DiR作為熒光探針標(biāo)記納米顆粒，尾靜脈注射BABL/C/Nudenu，利用活體成像手段實(shí)現(xiàn)對(duì)AINPs的腦內(nèi)遞藥特性的體外評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：我們制備出的AINPs透射電鏡下可見外觀圓整，大小均一，平均粒徑為143.6±0.7nm，Zeta電位為-25.61±3.53mV，體外實(shí)驗(yàn)中，End.3細(xì)胞株和原代大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCECs

6、）能有效攝取AINPs。體內(nèi)實(shí)現(xiàn)中，AINPs能顯著穿越BABL/C/Nudenu進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明我們制備的AINPs能有效的透過(guò)血腦屏障。
　　第三部分：Angiopep-2、IP10-EGFRvⅢscFv融合蛋白修飾納米粒聯(lián)合CTL的抗腦惡性膠質(zhì)瘤功能研究
　　目的：評(píng)價(jià)AINPs體外趨化特性和靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞特性，以及聯(lián)合CTL治療腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)。
　　方法：Transwell趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AINP

7、s的趨化特性，利用免疫熒光染色檢測(cè)AINPs抗原抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤抗原特異性DC細(xì)胞，并與CD8+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，制備出膠質(zhì)瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞CTL，并聯(lián)合AINPs經(jīng)尾靜脈注射BABL/C/Nudenu原位腦膠質(zhì)瘤模型，觀察荷瘤小鼠的生存時(shí)間及腫瘤體積的大小變化。
　　結(jié)果：AINPs能有效趨化CD8+T淋巴細(xì)胞，也能有效的與U87-EGFRvⅢ細(xì)胞株的特異抗原EGFRvⅢ特異結(jié)合。通過(guò)DC混合培養(yǎng)技術(shù)成功