載bFGF基因靶向聲學微泡制備及其預防跟腱損傷術后粘連的研究.pdf

1、第一部分載bFGF基因靶向生物素化陽離子聲學微泡的制備及其性質(zhì)檢測
　　目的：制備載bFGF基因的靶向聲學微泡，研究所制備微泡的基本性質(zhì)及其載基因能力，并進行體外大鼠肝臟顯影實驗。
　　方法：利用磷脂混懸液分別制備生物素化微泡、陽離子微泡、生物素化陽離子微泡，通過對大鼠肝臟進行聲學造影，比較分析不同種類微泡的顯影效果，通過“生物素-親和素”橋接法制備靶向生物素化陽離子微泡MBICAM-1，用熒光免疫染色及流式細胞儀檢測微泡和

2、抗ICAM-1單抗的結(jié)合情況，制備載bFGF基因的生物素化陽離子微泡，利用RT-PCR技術檢測生物化陽離子微泡載bFGF基因能力。光學顯微鏡下觀察上述所制備微泡的形態(tài)及分布，用分數(shù)顆粒計數(shù)儀檢測微泡的平均粒徑、濃度。
　　結(jié)果：利用磷脂懸浮液制備的三種微泡粒徑及濃度：生物素化陽離子微泡：平均粒徑：0.89um，濃度：2.6×109/ml；靶向生物素化陽離子微泡：平均粒徑：0.96um，濃度：1.9×109/ml；載bFGF基因生物

3、素化陽離子微泡：平均粒徑：1.08um，濃度：1.1×108/ml。光學顯微鏡下可見三種微泡形態(tài)尚規(guī)則，分布尚均勻；在熒光顯微鏡下可見熒光劑標記的靶向聲學微泡MBICAM-1表面可表達綠色熒光；通過流式細胞儀檢測微泡和抗ICAM-1單抗的結(jié)合率為93.3％；大鼠肝臟造影中三種微泡均表現(xiàn)為高增強，效果近似于臨床常用聲諾維微泡，其中制備的生物素化陽離子微泡顯影效果強于陽離子微泡和生物素化微泡；通過RT-PCR技術檢測目的基因與生物素化陽離子

4、微泡結(jié)果顯示：生物素化陽離子微泡的基因結(jié)合率最高可達37.3%。
　　結(jié)論：使用磷脂混懸液制備的微泡達到標準聲學微泡規(guī)格，所制備的微泡在大鼠肝臟造影效果好，類似臨床使用聲諾維微泡，其中生物素化陽離子微泡顯影效果最好，利用“生物素-親和素”橋接法制備的靶向聲學微泡MBICAM-1抗體結(jié)合率高，生物素化陽離子微泡攜帶基因的效率高，可作為一種理想的基因載體。
　　第二部分載bFGF基因靶向聲學微泡預防跟腱損傷術后粘連
　　目

5、的：研究靶向聲學微泡MBICAM-1在體內(nèi)及體外的靶向能力以及超聲輻照介導載bFGF基因靶向聲學微泡預防家兔跟腱損傷術后粘連的可能性。
　　方法：體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞，通過適量TNF液刺激，使臍靜脈內(nèi)皮細胞膜表達ICAM-1表面抗原，熒光顯微鏡下觀察臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞膜ICAM-1表面抗原表達情況，在顯微鏡下觀察經(jīng)TNF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞與與靶向生物素化陽離子微泡的體外結(jié)合情況。選取12只家兔，切斷一側(cè)跟腱腓腸肌支建立肌腱損

6、傷模型，給予跟腱斷端間斷縫合，制造跟腱損傷術后炎癥模型，將12只家兔分為4組：1組：單純模型組，2組：單純基因組，3組：超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽離子微泡；4組：超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽離子微泡。經(jīng)耳緣靜脈注入，跟腱局部給予超聲輻照，輻照條件為(Mylab90,LA523探頭,頻率：7-10MHZ，MI：0.8，ankle模式輻照10s，間隔10s，共20min)，觀察造影處理下，靶向聲學微泡與非靶向微泡組跟腱造影情

7、況，每天觀察家兔雙側(cè)跟腱表面有無紅腫以及行走步態(tài)；7天后，再次給予相同處理，14天后處死各組家兔，觀察家兔跟腱周圍組織的粘連情況，取跟腱標本進行H-E染色，觀察跟腱恢復及粘連情況，利用免疫組織化學法觀察跟腱ICAM-1表達情況。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察可見：經(jīng)TNF刺激后的臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞核表達藍色熒光，細胞膜表面表達綠色熒光；未經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞核表達藍色熒光，細胞膜表面不表達綠色熒光，說明經(jīng)TNF刺激可成功

8、使臍靜脈內(nèi)皮細胞表面表達ICAM-1膜表面抗原。體外靶向?qū)嶒灲Y(jié)果：經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細胞表面粘附有帶綠色熒光的靶向聲學微泡MBICAM-1；未經(jīng)TNF刺激的臍靜脈內(nèi)皮細胞表面粘附的靶向聲學微泡MBICAM-1數(shù)量較少，大多數(shù)靶向聲學微泡MBICAM-1分散漂浮在細胞間。造模后家兔跟腱肉眼情況觀察：1組家兔（單純模型組）活動明顯跛行，手術切口處可見縫線，周圍組織腫脹，傷口有少許滲出，跟腱與周圍組織都有中-重度粘連，可稍微和周圍組織分

9、離，跟腱斷端可見少許間隙，周圍組織充血腫脹；2組家兔（單純基因組）中度跛行，傷口基本愈合，但可見明顯疤痕，3只家兔跟腱與周圍組織都有重度粘連，完全不能與周圍組織分離，疤痕組織較多；3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽離子微泡）未見跛行，活動正常，周圍組織輕度水腫，傷口愈合良好，3只家兔跟腱光鮮，有輕度腫脹，質(zhì)地韌，彈性良好；4組家兔（超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽離子微泡）輕度跛行，周圍組織輕度水腫，傷口基本愈合，可見細小

10、疤痕，3只家兔跟腱光澤，有輕度腫脹，質(zhì)地較韌，彈性一般。造影模式（CEUS）下，造模后家兔跟腱觀察結(jié)果：非靶向生物素化陽離子微泡組：左側(cè)跟腱呈微弱增強；右側(cè)跟腱呈微弱增強。靶向生物素化陽離子微泡組：左側(cè)跟腱呈明顯增強。右側(cè)跟腱呈微弱增強。家兔跟腱蘇木素-伊紅（H-E）染色觀察發(fā)現(xiàn)：1組家兔（單純模型組）肌腱處膠原纖維排列紊亂、疏松，肌腱腱內(nèi)細胞成分與腱周細胞成分無明顯差異，并可見腱周疏松結(jié)締組織長入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界不清。2組家兔

11、（單純基因組）肌腱腱內(nèi)細胞成分較1組肌腱腱內(nèi)多，但是少于腱外細胞成分，且腱鞘外膠原纖維排列紊亂致密，不同簇纖維束相互粘連在一起，且長入肌腱斷端腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界不清。3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽離子微泡）肌腱處膠原纖維排列規(guī)則，肌腱腱內(nèi)細胞成分比腱周細胞成分多，無明顯腱外腱周疏松結(jié)締組織長入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界清楚。4組家兔（超聲+載bFGF基因非靶向生物素化陽離子微泡）肌腱處膠原纖維排列尚規(guī)則，肌腱腱內(nèi)細胞成分比

12、腱周細胞成分多，但較3組腱鞘內(nèi)細胞成分少，無明顯腱外腱周疏松結(jié)締組織長入肌腱腱鞘內(nèi)，腱鞘內(nèi)外分界清楚。家兔跟腱免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)：1組家兔（單純模型組）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達量與腱鞘外ICAM-1表達量基本持平，2組家兔（單純基因組）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達量明顯低于腱鞘外ICAM-1表達量，3組家兔（超聲+載bFGF基因靶向生物素化陽離子微泡）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達量明顯高于腱鞘外ICAM-1表達量，4組家兔（超聲+載bF

13、GF基因非靶向生物素化陽離子微泡）跟腱腱鞘內(nèi)ICAM-1表達量高于ICAM-1表達量。
　　結(jié)論：可通過TNF成功促使人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞膜表達ICAM-1膜抗原；可通過局部跟腱切開縫合建立跟腱損傷術后炎癥模型；采用“生物素-親和素”橋接法制備的靶向聲學微泡MBICAM-1在體內(nèi)外均具有靶向效果。可通過超聲輻照+靶向聲學微泡介導bFGF基因在家兔跟腱組織的表達，靶向聲學微泡能更有效促進bFGF基因與跟腱腱鞘內(nèi)組織相結(jié)合，從而使跟腱