蠶蛹羧甲基殼聚糖的制備與特性及其對大鼠術后腸粘連的預防作用.pdf

1、本文以繅絲或機打絲棉片后的廢蠶蛹（簡稱繅絲蛹）為原料，利用慢速冷凍-低溫解凍的凍融循環(huán)脫乙酰技術制備蠶蛹殼聚糖，并經過與氯乙酸的取代反應獲得蠶蛹羧甲基殼聚糖。本文詳細地研究了這種羧基殼聚糖的物化性能和結構特征，并研究其對成纖維細胞生長的影響以及對大鼠術后腸粘連的預防作用。
　　將繅絲蛹置于80-100?C烘箱內加熱烘干，待水分低于5％，機械粉碎成粉末。隨后通過正己烷的萃取，得到蛹油和脫脂蛹粉。脫脂蛹粉進一步通過氫氧化鈉脫蛋白，鹽酸

2、脫鹽和雙氧水脫色等加工步驟后得到蠶蛹甲殼素。蠶蛹甲殼素在堿性條件下經過-20?C與40?C反復凍融處理之后，得到蠶蛹殼聚糖。這種蠶蛹殼聚糖再通過堿化和氯乙酸取代反應制備了蠶蛹羧甲基殼聚糖。分析結果表明經過上述凍融循環(huán)技術制備的蠶蛹殼聚糖，其脫乙酰度在49.87%左右，粘均分子量僅為2.50×104。雖然脫乙酰度低，但是其在2%醋酸（HAc）中的溶解度仍然能達到96.73%。采用電位滴定法對蠶蛹羧甲基殼聚糖的取代度進行了分析，結果表明這種

3、羧甲基殼聚糖為N,O-羧甲基殼聚糖，取代度為1.63，屬于高取代度羧甲基殼聚糖。本文采用了SEM、XRD、DSC、FTIR和XPS等分析方法，對蠶蛹樣品的物理特性進行更全面和詳細的研究。SEM的分析證明蠶蛹殼聚糖和羧甲基殼聚糖樣品與對照品相比，表面更加不平整且顆粒斷裂情況嚴重。XRD、DSC、FTIR等分析結果表明，這種蠶蛹來源樣品的主要分子鏈結構與對照品相比無實質性差別。但是其結晶度和熱分解溫度都有所降低。
　　本文利用小鼠L9

4、29成纖維細胞在體外探索蠶蛹羧甲基殼聚糖對其增殖的影響。結果表明其能夠明顯抑制細胞的增殖，并能夠降低TGF-β1和VEGF基因的表達量。體內實驗通過磨損造成大鼠盲腸損傷粘連的模型，檢測各項生理生化指標及血清中的炎癥因子變化，并與現在臨床應用的抗粘連產品的作用效果作了比較研究。實驗動物采用60只雄性成年 SD大鼠（200-250 g/只），隨機分為空白對照（模型）組即生理鹽水處理組、陽性對照組即術億寧醫(yī)用幾丁糖凝膠處理組和實驗樣品組即自制

5、羧甲基殼聚糖處理。SD大鼠造模成功后，在術后2周和3周分別處死動物取血液和盲腸組織進行腸粘連等級及細胞因子等方面的分析與檢測。處死實驗動物后，暴露腹腔，通過肉眼觀察判定腸粘連等級，結果顯示陽性對照組和實驗組的大鼠術后腸粘連等級的平均值均低于空白對照（模型）組。血常規(guī)檢測結果顯示，實驗組和陽性對照組相比較，白細胞數目無顯著差異但都明顯低于生理鹽水處理的空白對照組，說明蠶蛹羧甲基殼聚糖與醫(yī)用幾丁糖凝膠一樣具有良好的抗炎癥作用。參與腸粘連形成

6、的細胞因子種類非常多，本項研究結果表明蠶蛹羧甲基殼聚糖溶液能明顯降低腸粘連大鼠血清中致炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8的表達量，而對抑炎因子IL-4的表達量并無影響。
　　此外，腸粘連組織中羥脯氨酸含量分析表明，陽性對照組和實驗組明顯降低，充分表明這兩組大鼠粘連程度也明顯降低。組織病理切片觀察結果說明蠶蛹羧甲基殼聚糖溶液能夠減少損傷盲腸組織纖維組織的增生以及炎癥細胞的浸潤，其效用與醫(yī)用幾丁糖凝膠并無顯

7、著差異。TGF-β1免疫組化分析結果表明蠶蛹羧甲基殼聚糖可以降低組織中TGF-β1的表達，從而減少腹膜粘連的形成。
　　綜上所述，本文利用凍融循環(huán)的脫乙酰方法制備脫乙酰度較低的蠶蛹殼聚糖，并通過與氯乙酸的取代反應制備了一種新型的蠶蛹羧甲基殼聚糖。體外成纖維細胞培養(yǎng)實驗證明這種羧甲基殼聚糖可以抑制細胞的增生，下調細胞中TGF-β1和VEGF基因的表達量；體內腸粘連實驗證明這種羧甲基殼聚糖通過降低機體炎癥因子（TNF-α、IL-1β、