不同分子量黃原膠的制備、分析及其預防大鼠術后腹腔粘連的研究.pdf

1、黃原膠(xanthan gum)是由甘藍黑腐病黃單胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的一種細胞外雜多糖，相對分子質(zhì)量（relative molecular weight，Mr）分布范圍為2×106-2×107，具有高穩(wěn)定性、假塑流變性、增稠性、懸浮性和乳化性以及安全性的特點。在醫(yī)藥領域中，黃原膠主要用作藥用輔料。黃原膠本身具有的特殊理化性能使其在生物醫(yī)藥領域具有較大開發(fā)潛力。目前已建立適合工業(yè)化生產(chǎn)的注射用黃原膠原

2、料藥制備工藝，制定了質(zhì)量標準，已進行對兔實驗性骨關節(jié)炎的療效和作用機制的研究。根據(jù)黃原膠高Mr、高黏彈性和高穩(wěn)定性的性質(zhì)，在術后防粘連等領域中還可有應用。Mr是表征黃原膠特性的基本參數(shù)之一，也是工業(yè)生產(chǎn)中質(zhì)量檢測的一個重要指標。不同Mr的黃原膠表現(xiàn)出不同的理化特性，其用途也不同。黃原膠的高穩(wěn)定性、高黏彈性等特性與其Mr密切相關，Mr越大，黃原膠溶液的黏度越高，黏彈性越好。因此，宜加大對高Mr黃原膠的生產(chǎn)、開發(fā)力度，進一步拓展黃原膠在醫(yī)藥

3、領域的應用范圍。本課題通過優(yōu)化發(fā)酵工藝進一步提高了黃原膠的Mr;制備了不同Mr的黃原膠，運用近紅外光譜分析技術（near-infrared spectroscopy，NIRS）建立了黃原膠Mr的定量分析模型，實現(xiàn)了黃原膠Mr的快速測定;考察了不同Mr黃原膠對大鼠術后腹腔粘連的預防效果。本研究分為三個部分：
　　第一部分：高Mr黃原膠的發(fā)酵優(yōu)化。
　　目的：通過發(fā)酵優(yōu)化獲得高Mr的黃原膠，建立高Mr黃原膠的發(fā)酵工藝。
　

4、　方法：使用搖瓶發(fā)酵，以黃原膠粗品溶液的黏度為考察指標，通過對發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間等條件以及氮源、碳源等培養(yǎng)基組成的考察，確定培養(yǎng)條件。隨后進行10L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定最終發(fā)酵工藝條件，并進行了50L規(guī)模的中試放大。黃原膠精制品Mr的測定采用體積排阻色譜結合多角度激光散射法(size exclusion chromatography combined with multi-angle laser light scatter

5、ing,SEC-MALLS)，為保證測定結果的準確性，測定了黃原膠精制品的dn/dc值。
　　結果：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及工業(yè)化發(fā)酵工藝條件為:葡萄糖4％，豆餅粉0.3％，酵母粉0.05％，檸檬酸0.1％，硫酸鎂0.01％，碳酸鈣0.4％，接種量4％，溫度28℃，發(fā)酵72 h，pH=7.0。采用補料分批發(fā)酵工藝，葡萄糖初始濃度2％，在第42 h一次性補加2％的葡萄糖。測得黃原膠分子在NaCl溶液中的dn/dc值為0.163。發(fā)酵優(yōu)化

6、后黃原膠的Mr為6.91×106，較優(yōu)化前Mr提高了30.4％。
　　結論：確定了高Mr黃原膠的工業(yè)化發(fā)酵工藝，篩選到了高Mr的黃原膠。
　　第二部分：基于近紅外光譜技術的黃原膠Mr快速檢測研究。
　　目的：采用NIRS結合偏最小二乘(partial least square，PLS)算法，建立一種快速檢測黃原膠Mr的方法。
　　方法：采用超聲降解法制備了一組具有一定Mr梯度的粉末狀黃原膠樣品，樣品標準Mr的測定

7、采用SEC-MALLS法。采集樣品的近紅外光譜并與SEC-MALLS測得的Mr數(shù)據(jù)進行關聯(lián)，采用主成分分析法對樣品集進行劃分，建立黃原膠Mr的NIRS分析模型。建模過程中，對光譜預處理方法和建模光譜區(qū)間進行選擇和優(yōu)化，并對比了兩種采樣方式，即積分球采樣模塊和光纖采樣模塊對建模效果的影響。
　　結果：兩種采樣方式均能實現(xiàn)黃原膠Mr的定量分析，而使用光纖采樣模塊采樣的建模效果要優(yōu)于使用積分球采樣模塊。最終，使用光纖模式采集光譜以獲得最

8、佳的模型效果，選取多元散射校正和均值中心化作為最佳的光譜預處理方法，在4000-4900 cm-1、5465-7100 cm-1和7345-8240 cm-1的光譜范圍內(nèi)建立黃原膠Mr的NIRS定量分析模型。該模型的校正集決定系數(shù)(R2c)、驗證集決定系數(shù)（R2p）、剩余預測偏差(RPD)和預測均方根誤差(RMSEP)分別為0.967、0.975、6.028和0.250×106。采用最佳PLS模型，從Mr檢測范圍、模型的線性、方法的準確

9、度以及精密度等方面，對黃原膠Mr的NIRS分析方法進行了方法學驗證。結果表明，在Mr為0.844×106-5.962×106的范圍內(nèi)具有良好的線性，R2=0.969，驗證集樣品的NIRS預測值與SEC-MALLS測定值之間無顯著性差異，重復性和中間精密度考察的相對標準偏差小于5％，測量的準確度和精密度能夠滿足黃原膠Mr的實際檢測要求。從樣品及樣品制備方法、采樣方式和樣品含水量3個方面探討了運用NIRS技術檢測黃原膠Mr的影響因素，發(fā)現(xiàn)樣

10、品的含水量是最主要的影響因素。在此基礎上，提出了該方法在實際運用中所應注意的操作規(guī)程，即:控制樣品的含水量，選擇光纖模式采譜，防止樣品吸濕，盡量縮短光譜的采集時間，以減少樣品含水量對該方法造成的影響。
　　結論：該方法簡單、實用，實現(xiàn)了黃原膠Mr的快速測定，其準確度和精密度能夠滿足實際檢測要求，有望成為一種黃原膠生產(chǎn)過程中快速檢測Mr的方法，可以作為質(zhì)控的標準，在工廠中實現(xiàn)對黃原膠Mr的在線分析。
　　第三部分：黃原膠預防大

11、鼠術后腹腔粘連的實驗研究。
　　目的：考察不同濃度及不同Mr黃原膠預防大鼠術后腹腔粘連的效果，評價腹腔注射黃原膠的安全性。
　　方法：手術造大鼠腹腔粘連模型后，在盲腸與腹壁受損部位分別噴涂0.5％、1％和2％(w/v)的黃原膠注射液、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(1.2％)或生理鹽水各1 mL。7d后取樣，觀察動物整體及局部反應，檢測血液學及血液生化指標，觀察心、肝、腎組織病理學變化并評價防粘連效果。使用Mr分別為6.91×106、4

12、.75×106和2.51×106的黃原膠制備1％的黃原膠注射液。手術造模后，在受損部位噴涂不同Mr黃原膠注射液、透明質(zhì)酸鈉凝膠或生理鹽水各1 mL。7d后取樣，評價不同Mr黃原膠腹腔注射的安全性及防粘連作用效果。使用旋轉(zhuǎn)流變儀對比了不同Mr黃原膠注射液的流變學特性。
　　結果：與生理鹽水組相比，不同濃度及不同Mr黃原膠組大鼠體重、血液學及血液生化指標等均無明顯改變（P＞0.05）;心、肝、腎組織未見明顯病理改變。與生理鹽水組相比，

13、噴涂黃原膠后，腹腔粘連的發(fā)生率和嚴重程度明顯降低（P＜0.05）。黃原膠的濃度越高，防粘連效果越好。1％高Mr黃原膠的防粘連效果優(yōu)于低Mr黃原膠。與1.2％醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠相比，高Mr的黃原膠在低剪切速率下具有更高的黏度和凝膠硬度。
　　結論：在大鼠腹腔噴涂不同濃度(0.5％～2％)及不同Mr的黃原膠1 mL，全身及局部未見明顯毒性作用。黃原膠能夠顯著降低模型動物術后腹腔粘連的發(fā)生率和嚴重程度。1％高Mr黃原膠的防粘連效果顯著優(yōu)