銀黃方不同分子量段膜分離物物質基礎和初步藥效的研究.pdf

1、1研究目的:
　　 本課題以銀黃方為研究對象,利用膜分離技術按分子量大小將銀黃方水煎液分成各級膜分離物。通過化學方法和儀器分析方法,對各級膜分離物中化學成分定性、定量研究。各級膜分離物與藥典方法制備的銀黃口服液進行比較,論述膜分離方法對于銀黃方有效成分分離、富集的科學性及可行性。結合各級膜分離物的抗炎實驗結果,觀察銀黃方膜分離物的抗炎作用,初步了解銀黃方膜分離物的藥效物質基礎。
　　 2研究方法:
　　 2.1膜

2、分離系統(tǒng)選擇
　　 采用HPLC法測定銀黃方膜分離物中黃芩苷和綠原酸的含量,以得率和轉移率為檢測指標,篩選出高效的膜分離組合系統(tǒng)。
　　 2.2銀黃方膜分離物共有峰的鑒定
　　 應用HPLC法建立銀黃口服液及銀黃方膜分離物的全成分指紋圖譜,通過比對各樣品的指紋圖譜,找出共有特征峰。
　　 2.3銀黃方膜分離物中化學成分歸屬鑒定
　　 利用HPLC-MS／MS聯(lián)用技術,對銀黃方膜分離物采用HPLC分

3、離后電噴霧質譜在線檢測的方法,鑒定膜分離物中各組分歸屬。
　　 2.4兩種制備工藝銀黃方中有效成分的定量研究
　　 2.4.1利用梯度洗脫HPLC同時測定銀黃口服液、銀黃方水煎液及各級膜分離物中黃芩苷、漢黃芩苷、綠原酸含量。
　　 2.4.2采用苯酚-硫酸法,應用紫外分光光度計測定銀黃口服液、銀黃方水煎液及各級膜分離物中多糖含量。
　　 2.4.3應用原子吸收分光光度法,測定銀黃口服液、銀黃方水煎液及各級

4、膜分離物中微量元素含量。
　　 2.5銀黃方膜分離物的抗炎作用分析
　　 以角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹模型為研究對象,容積法測定足腫脹度,硝酸還原酶法測定組織液和血清中NO含量,考察銀黃方膜分離物抗炎作用。
　　 3研究結果:
　　 3.1膜分離系統(tǒng)選擇
　　 對兩種膜組合的轉移率(膜間及水煎液)和藥材得率進行考察。第四級膜時,組合1(5000分子量)使30％左右的黃芩苷和50％以上的綠原酸被截留,

5、轉移率較低；組合2(2萬分子量)對黃芩苷和綠原酸的轉移率均可達90％以上。組合1的黃芩苷和綠原酸相對于水煎液轉移率分別為49.4％和26.2％,相對于藥材得率分別為9.2％和2.4％；組合2的黃芩苷和綠原酸相對于水煎液轉移率分別為103.6％和100.5％,相對于藥材得率分別為14.3％和4.3％。連續(xù)三批銀黃方水煎液膜分離效率穩(wěn)定性驗證結果:各級膜之間轉移率穩(wěn)定且高于70％,黃芩苷和綠原酸相對于水煎液轉移率均高于50％,分離效率高。<

6、br>　　 3.2銀黃方膜分離物共有峰的鑒定
　　 樣品銀黃口服液、銀黃方水煎液及一至五級膜分離物的指紋圖譜經共有峰分析,確定了銀黃方水煎液及一至五級膜分離物中存在9個共有峰,銀黃口服液中存在其中4個色譜峰,分別為一號峰(綠原酸)、五號峰(黃芩苷)、八號峰(未知物)、九號峰(漢黃芩苷),缺少其余五個色譜峰。
　　 3.3銀黃方膜分離物中化學成分歸屬鑒定
　　 黃芩水煎液、金銀花水煎液、銀黃方水煎液、銀黃口服液、

7、銀黃方第五級膜分離物的HPLC圖譜縱向疊加得出:金銀花和黃芩共煮過程中未發(fā)現(xiàn)有新成分出現(xiàn)及成分消失,指認9個色譜峰中1、2、3、4號峰來自金銀花藥材,其余來自黃芩藥材。鑒定了銀黃方膜分離物中5個已知化合物分別為綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素。比對文獻推斷了4個化合物可能的結構,分別為綠原酸同分異構體、兩個異綠原酸同分異構體、千層紙甲苷。
　　 3.4兩種制備工藝銀黃方中有效成分的定量研究
　　 3.4.1黃芩

8、苷、綠原酸、漢黃芩苷測定結果:銀黃方第五級膜分離物中黃芩苷、綠原酸、漢黃芩苷得率(6.50％)高于藥典工藝制備的銀黃方(3.67％)。以黃芩苷、綠原酸相對于飲片中有效成分的轉移率和成品量為指標,得出銀黃方第五級膜分離物的黃芩苷、綠原酸轉移率(49.89％,80.20％)和成品量(2.91mL·g-1生藥,14.04mL·g-1生藥)均高于藥典工藝制備的銀黃方的黃芩苷、綠原酸轉移率(28.28％,63.76％)和成品量(1.65mL·g-

9、1生藥,11.16mL·g-1生藥)。
　　 3.4.2多糖測定結果:銀黃方第五級膜分離物中多糖質量(1.06g)最低,銀黃方水煎液中多糖質量(163.48g)最高,各級膜分離物中多糖質量均不等。
　　 3.4.3微量元素測定結果:共測定了13種元素包括銅、鋅、錳、鐵、鉻、鎘、鉛、鈣、鍶、鎳、鈷、鈉、鋇,銀黃方水煎液中檢測到8種分別為銅、鋅、鐵、錳、鈣、鍶、鎳、鋇,第一、五級膜分離物和銀黃口服液中4種元素分別為鋅、鐵、錳

10、、鈣,第二、三、四級膜分離物中3種元素分別為鋅、鐵、鈣。檢測到微量元素總質量由高至低排序為銀黃方水煎液(2.89)>第五級膜分離物(0.99)>銀黃口服液(0.41)>第一級膜分離物(0.24)>第四級膜分離物(0.15)>第三級膜分離物(0.11)=第二級膜分離物(0.11)。
　　 3.5銀黃方膜分離物的抗炎作用分析
　　 銀黃方膜分離物對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的抗炎作用結果:由足腫脹度結果可知,地塞米松組、銀黃方

11、第三級、五級膜分離物組均有抗炎作用。與模型組比較,地塞米松組在致炎后4、5h表現(xiàn)出抗炎作用差異顯著(P<0.05),銀黃方第三級、第五級膜分離物分別在致炎后1、2h和1、2、6h表現(xiàn)出抗炎作用差異非常顯著(P<0.01)。由血液及組織液中NO含量可知,除銀黃方第二級膜分離物外,其余各組均有抗炎作用。與模型組比較,第一級膜分離物抗炎作用表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05),其余各組抗炎作用均表現(xiàn)出非常顯著差異(P<0.01)。
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12、結論:
　　 4.1膜分離系統(tǒng)選擇
　　 黃芩苷、綠原酸的轉移率(膜間及水煎液)和藥材得率三個指標,從不同角度考察了兩種組合膜分離系統(tǒng)分離效率,證明組合2膜分離系統(tǒng)分離效率優(yōu)于組合1。連續(xù)三批銀黃方水煎液膜分離,驗證了組合2膜分離系統(tǒng)用于本研究的可行性及穩(wěn)定性。故選擇組合2的膜分離系統(tǒng)進行本課題的研究。
　　 4.2銀黃方膜分離物共有峰的鑒定
　　 由HPLC圖譜分析,確定了銀黃方水煎液及一至五級膜分離物

13、中存在9個共有峰,銀黃口服液中存在其中4個色譜峰。說明膜分離方法可以保留組方更多原有化學成分,比藥典方法制備的銀黃口服液中化學成分種類和數(shù)量多。
　　 4.3銀黃方膜分離物中化學成分歸屬鑒定
　　 銀黃方膜分離物中化學成分經HPLC-MS／MS分析,鑒定了銀黃方膜分離物中5種化合物的歸屬,推斷了4種化合物的可能結構。與黃芩、金銀花藥材比較,發(fā)現(xiàn)銀黃方膜分離物中化學成分種類沒有損失。銀黃口服液與銀黃方膜分離物比較,缺少其中

14、8、9號峰,即黃芩素和漢黃芩素。說明銀黃方膜分離物保留了組方更多原有化學成分種類。
　　 4.4兩種制備工藝銀黃方中有效成分的定量研究
　　 4.4.1黃芩苷、綠原酸、漢黃芩苷的含量測定:銀黃方第五級膜分離物中黃芩苷、綠原酸、漢黃芩苷相對于藥材得率高于藥典工藝制備的銀黃方。其黃芩苷、綠原酸轉移率和成品量均高于藥典工藝制備的銀黃方。充分證明了膜分離工藝應用于中藥復方有效成分或有效部位的分離、富集的可行性。
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15、.4.2多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、促進免疫等方面都發(fā)揮著重要生物活性。因此對多糖的測定有著重要的意義[1]。本實驗測定各級膜分離物多糖質量和低于水煎液中質量,可能為水煎液中部分多糖被截留在膜分離系統(tǒng)所致。多糖通過膜分離系統(tǒng),每級膜截留得到多糖質量不等,說明多級膜分離系統(tǒng)也能按分子量將不同分子量段多糖分段分離。
　　 4.4.3由各樣品中微量元素質量和排序可知,銀黃方水煎液及第五級膜分離物中微量元素質量和

16、均高于銀黃口服液,說明傳統(tǒng)合煎的方法以及合煎后膜分離方法比藥典方法更有利于保證原有微量元素含量。且膜分離方法對于微量元素同樣起到了分離、富集的作用。
　　 4.5銀黃方膜分離物的抗炎作用分析
　　 應用角叉菜膠致大鼠足腫脹模型,觀察銀黃方膜分離物的早期抗炎作用。以足腫脹度、血清和組織液中NO含量為評價指標,得出銀黃方膜分離物具有抗早期炎癥作用,且第五級膜分離物抗炎作用最明顯,第三和第四級膜分離物抗炎作用與模型組比較也有顯

17、著差異,推測是因為第三和第四級膜分離物中黃芩苷、綠原酸、漢黃芩苷、多糖、微量元素相對于干膏含量高(71.7％,98.4％),銀黃方第三、四級膜分離物得干膏重量較低,可將三、四、五級膜分離物合并為終產物。與第五級膜分離物比較,上述成分相對于干膏含量可提高6.6個百分點,相對于藥材得率提高3.3個百分點,相對于水煎液轉移率提高13.2個百分點。
　　 4.6綜上所述,可知從化學角度和藥效學角度均證明了膜分離技術應用于中藥復方有效成分