攜RGDS脂膜氟烷微泡的制備及靶向作用研究.pdf

1、超聲造影劑(ultrasoundcontrastagent，UCA)是一類(lèi)能夠顯著增強(qiáng)血液超聲散射信號(hào)的診斷試劑，在人體微小血管和組織血流灌注檢測(cè)與成像方面具有血流成像真實(shí)、實(shí)時(shí)高幀頻偽像少、操作簡(jiǎn)便、無(wú)毒副作用、無(wú)損性、適用面廣等優(yōu)點(diǎn)，因此在影像醫(yī)學(xué)診斷方面顯示出很好的應(yīng)用前景。目前市面上所使用的超聲造影劑均為非特異性血池顯影劑，無(wú)特異靶向性，故靶向超聲造影劑已成為近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 靶向超聲造影劑由于在微泡上裝配了特異性

2、靶向配體，理論上的應(yīng)用熱點(diǎn)包括血栓、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、腫瘤新生血管以及炎癥等的顯影和治療。靶向造影較普通造影更具有特異性，是一種潛在的疾病特異診斷方法。國(guó)外的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研制出針對(duì)腫瘤血管，血栓，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的靶向超聲造影劑，國(guó)內(nèi)靶向超聲造影劑的研制目前處于起始階段。使微泡具有靶向超聲造影的方法有：①利用微泡外殼的化學(xué)和電荷特性使之滯留于病變部位；②在微泡表面連接特異性抗體或配體，使之結(jié)合到病變部位細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原上；③利用分子橋

3、作用，將疾病相關(guān)的單克隆抗體與微泡結(jié)合，從而間接使微泡與病變部位表達(dá)的相關(guān)抗原結(jié)合，達(dá)到靶向性顯影和治療的目的。 動(dòng)靜脈血栓形成是造成血管閉塞的常見(jiàn)原因，由此導(dǎo)致的心血管疾病是人類(lèi)死亡的主要原因之一。所以能夠及時(shí)準(zhǔn)確的了解血栓的大小，形態(tài)，側(cè)枝循環(huán)狀況為臨床提供治療依據(jù)已成為現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但是最行之有效的方法仍然處于探索之中。 攜RGDS的脂膜氟烷微泡(靶向微泡)是通過(guò)識(shí)別激活的血小板表面高密度表達(dá)的血小板糖蛋白

4、(glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)受體而發(fā)揮靶向作用的，GPⅡb/Ⅲa受體存在于血小板表面管道膜和α顆粒中，當(dāng)血小板被激活時(shí)，這些細(xì)胞內(nèi)受體即在血小板表面表達(dá)。GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物是纖維蛋白原的受體，其主要功能是與纖維蛋白原結(jié)合。它還可以與其它含有Arg-Gly-Asp(RGD)片段的粘附蛋白如VonWillebrandFactor(vWF)、纖維連接蛋白等結(jié)合，參與血小板的粘附與聚集。GPⅡb/Ⅲa與RGD序列的結(jié)

5、合位點(diǎn)在GPⅢa的109-171殘基的63個(gè)氨基酸的一段序列中。RGDS短肽是血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受體的拮抗劑，具有對(duì)血栓部位活化血小板的趨向性，能與血小板Fg片段特異性結(jié)合，可望作為血栓靶向制劑的導(dǎo)向彈頭。將微泡造影劑的外殼連接上能識(shí)別血栓的RGDS短肽后，造影劑便具有了血栓靶向性。MRX-408(Aerosomes)是目前研制的一種GPⅡb/Ⅲa受體的靶向造影劑(ImaRxPharmaceuticalCorp,Tucson，AZ

6、，USA)，它是在MRX-408脂質(zhì)微泡的表面連接了一個(gè)可被GPⅡb/Ⅲa受體精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別的寡肽序列，在超聲作用下可提高對(duì)血栓的識(shí)別能力。 本研究的目的是探討制備具有親血栓性的脂膜超聲造影劑的方法，測(cè)定其生物學(xué)活性，并評(píng)價(jià)其對(duì)血栓的靶向效果。 方法： (1)采用共價(jià)鍵合的方法制備攜RGDS的脂膜氟烷微泡：將二硬脂酰磷脂酰膽堿(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-

7、3-phosphoglycerol，DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPG)與氨基聚乙二醇(diamino-polyethyleneglycol，PEG-AT)按一定比例水合，經(jīng)西林瓶分裝、凍干處理后，加入糖溶液及表面活性劑，搖勻即得到脂質(zhì)混懸液；然后，將激活劑碳化二亞胺鹽酸鹽與標(biāo)記有熒光異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyana

8、te，F(xiàn)ITC)的短肽片段RGDS以一定比例混合，反應(yīng)一段時(shí)間后，加入到上述已制備好的脂質(zhì)混懸液液中，并加以全氟丙烷進(jìn)行氣體置換后，采用國(guó)產(chǎn)機(jī)械振蕩儀，選擇合適的功率和時(shí)間予以振蕩后靜置片刻，去下清液，即得到初始的攜RGDS脂膜氟烷微泡；再用緩沖液(PBS)沖洗數(shù)次去掉游離的短肽片段，棄下清液，將得到的產(chǎn)物(靶向微泡)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)和血栓尋靶效果的研究。 (2)采用表面粘附法制備攜RGDS的脂膜氟烷微泡：制備流程和材料基本同(1)

9、，不同的是制備材料中去掉橋連劑PEG-AT，用等量PEG(聚乙二醇)4000取代(我科實(shí)驗(yàn)室自制的長(zhǎng)效脂膜氟烷超聲造影劑“脂氟顯”中的膜材料)。 (3)微泡鑒定方式：①普通光鏡下觀察微泡的形態(tài)，大小，分布及穩(wěn)定性；②熒光顯微鏡下觀察微泡的熒光標(biāo)記情況；③流式細(xì)胞儀分析微泡RGDS攜帶率和穩(wěn)定性。 (4)體外尋靶實(shí)驗(yàn)方法：①新鮮血液直接涂片法：采集人體外周靜脈新鮮血液常溫下涂片，分別加入表面粘附法和共價(jià)鍵合法制備的靶向微泡

10、，孵育后用PBS液沖洗涂片數(shù)次，蓋上蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡評(píng)價(jià)其對(duì)離體血栓的親和性。②建立膠原直接暴露法：將Ⅰ型膠原蛋白和Ⅳ型膠原蛋白配置成為一定濃度的混合溶液，均勻的涂抹于載玻片上，室溫放置10分鐘，注入富含血小板的血漿10μl，肉眼觀察玻片干燥以后，分別加入普通脂膜超聲造影劑微泡和攜RGDS脂膜超聲造影劑，1min后漂洗玻片，沖洗掉沒(méi)有粘附上的微泡，然后采用光鏡和熒光顯微鏡觀察評(píng)價(jià)其對(duì)離體血栓的親和性。③萬(wàn)倍顯微鏡拍攝靶向超聲造影

11、劑尋靶過(guò)程：采集正常人靜脈血，不加任何抗凝劑，靜置1.5h后形成全血細(xì)胞凝塊(即紅色血栓)。血凝塊放入冰凍切片機(jī)冷凍盤(pán)，切片制好后備用。將血塊隨機(jī)分為A、B、C三組，A組加入攜RGDS脂膜氟烷微泡(靶向微泡)；B組加入普通超聲造影劑(非靶向微泡)；C組加入生理鹽水。3min后使用PBS液沖洗掉游離的微泡，100倍顯示精度，19520放大倍數(shù)，觀察微泡運(yùn)動(dòng)，采用ND25中性密度濾色片。 (5)共價(jià)鍵合制備的靶向微泡對(duì)體外血栓的助溶

12、效果：采集正常人靜脈血放在于試管中，不加任何抗凝劑，靜置2h后，得到一個(gè)全血細(xì)胞凝塊(即紅色血栓)。相同方法共得到血栓60塊(每塊1ml靜脈血)，稱(chēng)量濕重，平均重量為(0.37士0.07)g。將血塊隨機(jī)分為A、B、C三組：A組分別加入共價(jià)鍵合制備的靶向微泡；B組分別加入非靶向微泡；C組分別加入生理鹽水。采用超聲治療儀，功率1.2W/cm2，距離3cm，治療時(shí)間15min，電鏡掃描經(jīng)溶栓后的血塊表面結(jié)構(gòu)。 (6)共價(jià)鍵合制備的靶向

13、微泡對(duì)體外血栓的顯影效果的研究：健康人體新鮮血塊10塊，大小2cm×1cm×1cm，以蠕動(dòng)泵為循環(huán)動(dòng)力，4％琥珀酰明膠注射液為循環(huán)液，以輸液器為材料建立一密閉式體外循環(huán)系統(tǒng)，模擬人體體循環(huán)，血塊置于容器內(nèi)，采用高頻探頭超聲檢查，目測(cè)觀察靶向微泡對(duì)血栓的顯像效果。 結(jié)果： (1)微泡的外觀及鏡下所見(jiàn)，標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(FITC)的攜RGDS的脂膜氟烷微泡外觀呈淺黃色混懸液。光鏡下共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡分布，粒徑

14、范圍與非靶向脂膜微泡相比，無(wú)顯著性差異。熒光顯微鏡下，共價(jià)鍵合制備的RGDS的脂膜氟烷微泡外殼發(fā)出明亮的黃綠色熒光，而表面粘附法RGDS的脂膜氟烷微泡經(jīng)PBS液清洗后在熒光顯微鏡檢查時(shí)表現(xiàn)為無(wú)熒光，或僅見(jiàn)零星非特異微弱熒光。 (2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示共價(jià)鍵合法制備的攜RGDS的脂膜氟烷微泡可以達(dá)到82.96％的RGDS短肽片段結(jié)合率。 (3)激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果提示共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡富集于血栓的邊緣，而普

15、通脂膜超聲造影劑不存在這種現(xiàn)象。 (4)在人工模擬內(nèi)源性凝血系統(tǒng)形成的血栓中，在熒光顯微鏡下可以看到共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡富集于激活的血小板周?chē)?，而表面粘附RGDS的脂膜氟烷微泡只是隨機(jī)分布于血小板周?chē)瑳](méi)有觀察到微泡富集現(xiàn)象。 (5)萬(wàn)倍顯微鏡拍攝共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡尋靶過(guò)程，共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡粘附血栓后微泡動(dòng)度低，沖洗后微泡數(shù)量減少不明顯以及少量的浮動(dòng)現(xiàn)象；普通微泡粘附血栓后在原位高速運(yùn)

16、動(dòng)，經(jīng)PBS液沖洗后微泡急劇減少，并存在高速的原位浮動(dòng)現(xiàn)象。 (6)超聲介導(dǎo)造影劑助溶體外血凝塊實(shí)驗(yàn)，生理鹽水組溶栓前后血塊表面依然有光澤，大小改變不明顯；普通超聲造影劑組血塊表面失去了光澤，大小改變不明顯；攜RGDS的脂膜氟烷微泡(靶向微泡)組血塊表面不僅失去了光澤，其體積縮小程度明顯。電鏡掃描顯示，生理鹽水組血凝塊經(jīng)消融后表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，靶向微泡組可見(jiàn)大量均勻分布的空洞和裂隙，普通超聲造影劑組僅見(jiàn)少量分布的小型凹陷及微小

17、裂隙。 (7)模擬的大多數(shù)靜脈通道的循環(huán)流速條件下，非靶向微泡加入循環(huán)容器后，逐漸在血栓邊緣形成線(xiàn)狀的反光帶，但內(nèi)部充填效果不佳，目測(cè)內(nèi)部輕度充填；靶向微泡加入循環(huán)容器后，逐漸在血栓邊緣形成強(qiáng)烈的反光帶，目測(cè)血栓內(nèi)部大部分充填。冰凍切片顯微鏡觀察：100倍下觀察，非靶向組血栓切片邊緣有少量微泡粘附或沿著血栓邊緣呈線(xiàn)狀分布，400倍下，可見(jiàn)血栓縫隙內(nèi)零星微泡存在；靶向微泡組100倍下即可見(jiàn)到密集的微泡沿血栓邊緣向內(nèi)分布延伸，400

18、倍下血栓縫隙內(nèi)微泡密集分布，沿著縫隙向內(nèi)延伸，形成樹(shù)枝狀分隔。 結(jié)論： (1)用共價(jià)鍵合的化學(xué)修飾方法成功制備了攜RGDS的脂膜氟烷微泡，與表面粘附法制備的RGDS脂膜氟烷微泡比較具有更好的血栓靶向性。 (2)治療超聲介導(dǎo)下的超聲造影劑具有助溶作用，共價(jià)鍵合RGDS的脂膜氟烷微泡較非靶向超聲造影劑具有更強(qiáng)的助溶效果。 (3)攜RGDS的脂膜氟烷微泡能夠明顯提高超聲圖像的信噪比，特別是血栓內(nèi)部的回聲顯著增強(qiáng)