酒石酸衍生的陽離子脂質材料的制備及其基因轉染活性研究.pdf

1、目的：
　　基因治療需要高效安全的載體系統(tǒng)將基因遞送到靶細胞或細胞核內(nèi)?；蛑委熭d體主要分為病毒載體與非病毒載體兩大類。非病毒載體因其負載量大，穩(wěn)定性和安全性高，易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，成為目前基因載體研究的熱點。陽離子脂質體是目前研究最為廣泛的非病毒載體，在基因治療中具有廣闊的發(fā)展與應用前景。本論文以酒石酸為骨架，通過在酒石酸羥基端引入氨基己酸為陽離子頭部，在其羧基端引入不同長度的疏水鏈制備得到新型骨架的陽離子脂質材料，以期為基因

2、治療提供高效低毒的載體。
　　方法：
　　以 L-（+）-酒石酸，6-氨基己酸，長鏈烷基胺或醇（辛胺，十二胺，十六胺，辛醇，十二醇，十六醇）等為原料，構建了單鏈陽離子脂質材料（TS1-TS3）和雙鏈陽離子脂質材料（TD1-TD3）。采用質譜、核磁、紅外等方法對合成的材料進行結構鑒定。
　　將上述脂質材料與輔助脂質 DOPE按照一定比例混合，采用薄膜分散法制備得到陽離子脂質體并對其進行表征和細胞毒性評價。
　　采用

3、凝膠電泳阻滯方法考察所得6種陽離子脂質體與質粒DNA的復合能力和核酶降解保護作用，為基因轉染篩選適宜的N/P比。以293T細胞和報告基因pEGFP-N1為模型，采用流式細胞儀和熒光顯微鏡對上述陽離子脂質體的轉染能力進行初步評價。對初篩轉染活性較好的陽離子脂質材料進行處方優(yōu)化，并進一步考察其在HeLa細胞中的轉染活性。選用不同細胞內(nèi)吞途徑抑制劑觀測 TD2/DNA復合物的入胞機制。
　　結果：
　　設計合成了6種基于L-（+）

4、-酒石酸的陽離子脂質材料，包括3種單鏈陽離子脂質材料TS1-TS3和3種雙鏈陽離子脂質材料TD1-TD3，經(jīng)1H NMR，MS和IR等方法鑒定，所得脂質材料的結構與目標物的結構一致。
　　陽離子脂質體粒徑及zeta電位測定結果表明，所制備的6種陽離子脂質體粒徑均小于150nm，zeta電位均在35 mV以上，滿足基因遞送載體的要求。MTT細胞毒性實驗結果表明，所設計的陽離子脂質材料毒性較低，具有較好的生物相容性，上述陽離子脂質體除

5、TD1外，IC50均大于陽性對照DOTAP。
　　凝膠阻滯實驗結果顯示，在N/P比小于3的情況下，所制備的陽離子脂質體均能與DNA完全復合，具有較強的攜載DNA能力。6種載體材料在293T細胞中的基因轉染活性測定結果表明，單鏈陽離子脂質材料TS1-TS3脂質體轉染活性均較差，與裸DNA幾乎無差異。雙鏈陽離子脂質材料TD1轉染能力較弱，TD2和TD3具有較好的轉染活性。TD2和TD3的進一步處方優(yōu)化結果顯示，最優(yōu)脂質材料/DOPE比

6、例分別為1:0.5和1:2；最優(yōu)N/P比均為1:1。與陽性對照DOTAP相比，TD2（MFI153.3±14.7）和TD3（MFI190.5±7.8）的平均熒光強度與DOTAP（MFI171.1±14.5）無顯著性差異，但TD2（47.7％±7.0%）與TD3（32.9%±2.0%）兩者的陽性轉染細胞百分數(shù)均高于DOTAP（24.7%±1.8%；P<0.01），具有更好的轉染活性。HeLa細胞上的轉染實驗結果表明，TD2（MFI53.8

7、±6.2）和TD3（MFI54.7±2.0）的平均熒光強度雖小于DOTAP（MFI98.0±1.8，P<0.01），但TD3（19.6%±0.9%）的陽性轉染細胞百分數(shù)與DOTAP（18.3%±0.9%）相當，TD2（25.6%±0.4%）的陽性轉染細胞百分數(shù)仍優(yōu)于DOTAP，具有較強的基因轉染能力。TD2/DNA復合物入胞機制研究結果表明，TD2與DNA形成的復合物主要通過小窩蛋白介導的途徑入胞。
　　結論:
　　本論文在

8、 L-（+）-酒石酸骨架中引入6-氨基己酸作為陽離子頭部，引入不同長度的疏水鏈分別構建了單鏈與雙鏈疏水尾部的6種陽離子脂質材料并對其細胞毒性和基因轉染活性進行研究。研究結果顯示，除TD1外，上述陽離子脂質材料所得基因載體具有粒徑均一，細胞毒性小，攜載和保護DNA能力強等優(yōu)點。其中TD2陽離子脂質體的基因轉染能力最強，在293T和HeLa細胞系上均顯示很好的轉染活性，且TD2與DNA形成的復合物主要通過小窩蛋白介導的途徑入胞，該途徑可以避