腫瘤凝血相關(guān)分子為治療靶點(diǎn)的納米遞藥研究.pdf

1、納米遞藥系統(tǒng)的開發(fā)是目前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問題。其治療基礎(chǔ)是腫瘤的增強(qiáng)滲透與滯留（EPR）效應(yīng)，即腫瘤內(nèi)的血管和淋巴管功能不完善，血管內(nèi)皮細(xì)胞間間隙較大，使得納米粒子可以較小分子藥物更好地滲透到腫瘤間質(zhì)，而淋巴回流障礙又使得納米粒子可以有效滯留在腫瘤組織內(nèi)不易被清除。然而僅僅依靠腫瘤的EPR效應(yīng)，難以收到重復(fù)性較好的治療效果。主要是由于不同的腫瘤其 EPR效應(yīng)不完全相同，血管豐富的腫瘤 EPR效應(yīng)較強(qiáng)，血管稀少而間質(zhì)豐富的腫瘤，EP

2、R效應(yīng)就很弱。即使同一類型的腫瘤，在不同的發(fā)展階段其 EPR效應(yīng)也不盡相同。此外，復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，包括細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)血管的擠壓而導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)血流灌注不均一，以及細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)納米藥物的阻力作用，也在一定程度上影響腫瘤的EPR效應(yīng)。
　　腫瘤局部存在高凝狀態(tài)，主要是由于諸多常見腫瘤，如肺癌，膠質(zhì)瘤，乳腺癌等均過表達(dá)凝血的啟動(dòng)物-組織因子（TF），而循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)凝血相關(guān)因子會(huì)通過腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙滲漏到腫瘤組織內(nèi)部，在TF的作用下引發(fā)凝

3、血瀑布，使得腫瘤細(xì)胞外間質(zhì)中富集大量凝血反應(yīng)的終產(chǎn)物纖維蛋白-纖維連接蛋白（FNs）復(fù)合物。此外，F(xiàn)Ns還可以作為腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分由腫瘤內(nèi)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞大量合成。這些凝血相關(guān)分子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中都扮演極其重要的角色。一方面，凝血的始動(dòng)因子TF可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化及腫瘤轉(zhuǎn)移，和許多腫瘤的惡性分級(jí)緊密相關(guān)。另一方面，凝血相關(guān)的終末產(chǎn)物纖維蛋白及具有血栓穩(wěn)定作用的 FNs作為腫瘤基質(zhì)的重要組成部分，是腫瘤血管

4、新生的支架所在，可以有效引導(dǎo)腫瘤內(nèi)血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并引導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。此外，這些基質(zhì)成分還可能會(huì)擠壓腫瘤的新生血管，使得腫瘤內(nèi)部的血液灌注不均一，形成很多缺氧灶而引起腫瘤惡化轉(zhuǎn)移。
　　鑒于以上研究背景，我們希望建立以凝血相關(guān)分子為治療靶點(diǎn)的納米遞藥系統(tǒng)，以提高對(duì)惡性腫瘤的治療效果。一方面，由于腫瘤內(nèi)過表達(dá)TF及FNs，我們可以將其作為遞藥的定位靶點(diǎn)，將與TF或FNs具有高親和力的靶向功能分子修飾在納米粒表面，在靶向功能分子

5、的導(dǎo)向作用下，納米遞藥系統(tǒng)可以更好地濃集到腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)更為有效的腫瘤遞藥。另一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的策略來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的凝血相關(guān)成分，如纖維蛋白或FNs。將腫瘤微環(huán)境中這些基質(zhì)成分有效破壞后，可以在一定程度上增加腫瘤內(nèi)的有效血流灌注，增加藥物遞送到腫瘤組織；并且減少納米藥物瘤內(nèi)穿透的阻力，使納米藥物得以在腫瘤內(nèi)部更好地分布，從而實(shí)現(xiàn)更為有效的納米藥物的腫瘤內(nèi)遞送。
　　本文第一部分我們建立了以TF或FNs為定位靶點(diǎn)的主動(dòng)靶向

6、遞藥系統(tǒng)。
　　第一章為針對(duì)腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞TF的多靶點(diǎn)納米遞藥系統(tǒng)的研究。課題組前期研究設(shè)計(jì)了來源于 VII因子的融合蛋白 EGFP-EGF1，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白對(duì)TF具有特異性的高親和力。我們將該蛋白連接在納米粒（NP）表面，制備成了具備TF靶向性的納米粒（ENP），考察其對(duì)TF過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶向性及靶向治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以TF過表達(dá)的大鼠來源的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人來源的肺癌A549細(xì)胞作為細(xì)胞模型，與普通納米粒

7、NP相比，EGFP-EGF1的修飾可以增加納米粒到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并且更容易殺死腫瘤細(xì)胞；小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，在皮下荷 A549腫瘤模型及原位腦膠質(zhì)瘤模型中，ENP在腫瘤內(nèi)的分布約為NP的2.3倍和2.4倍；體內(nèi)組織切片進(jìn)一步證實(shí) ENP可以同時(shí)靶向腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及腫瘤基質(zhì)細(xì)胞包括腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞；藥效學(xué)結(jié)果表明，ENP更好地抑制皮下荷瘤小鼠模型腫瘤的生長(zhǎng)（腫瘤體積抑制率為60.53％）并延長(zhǎng)了荷原位腦膠質(zhì)瘤小鼠

8、模型的中位生存時(shí)間約93%，明顯優(yōu)于普通NP和游離藥物。
　　第二章為針對(duì)腫瘤基質(zhì)中FNs的主動(dòng)靶向納米遞藥系統(tǒng)研究。我們首先通過免疫熒光染色證實(shí)體外腫瘤球及體內(nèi)荷原位腦膠質(zhì)瘤小鼠模型的腦腫瘤部位均有大量的FNs沉積，為進(jìn)一步研究提供了可靠的研究模型。我們將與FNs有特異性親和力的短肽CLT1修飾在納米遞藥系統(tǒng)表面，構(gòu)建了針對(duì)腫瘤基質(zhì)中FNs的主動(dòng)靶向納米遞藥系統(tǒng)（CNP）。腫瘤球滲透實(shí)驗(yàn)表明CNP可以更容易滲透到腫瘤球深部，與N

9、P比較可以深入腫瘤球內(nèi)約40μm，腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示CNP組的瘤體積僅為對(duì)照組49.5%，明顯優(yōu)于NP和游離藥物；小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNP可以靶向到達(dá)膠質(zhì)瘤部位，熒光強(qiáng)度約為NP的2.1倍；體內(nèi)組織切片表明普通NP主要是位于腫瘤細(xì)胞外，而該納米系統(tǒng)更容易到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部；藥效學(xué)結(jié)果表明，CNP能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，顯著延長(zhǎng)荷原位腦膠質(zhì)瘤小鼠模型的生存時(shí)間。
　　本文第二部分，我們以腫瘤微環(huán)境中凝血相關(guān)分子，如纖維蛋白，F(xiàn)N

10、s為治療靶點(diǎn)聯(lián)合納米遞藥系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行遞藥研究。不同類型的腫瘤，其微環(huán)境中的凝血相關(guān)成分有所不同，針對(duì)不同類型的腫瘤，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的策略來進(jìn)行研究。
　　本部分第一章為溶栓藥物調(diào)控腫瘤微環(huán)境中纖維蛋白聯(lián)合納米遞藥系統(tǒng)治療腫瘤的研究。本章我們選擇了基質(zhì)與新生血管均較為豐富的A549肺癌作為研究模型。由于該類型腫瘤具有大量的新生血管，血流中的凝血相關(guān)成分可以通過腫瘤內(nèi)新生血管有效滲漏并在TF作用下形成纖維蛋白。通過免疫熒光染色我們證

11、實(shí)大量纖維蛋白主要分布腫瘤新生血管附近。通過腹腔注射給予重組組織型纖溶酶原激活劑（rtPA）（25 mg/kg，共2周）后，荷瘤小鼠模型的腫瘤內(nèi)纖維蛋白被大量破壞，而纖維蛋白對(duì)血管的擠壓也隨之減弱，腫瘤內(nèi)的功能化血管由38.3±3.9%增加到了75.5±7.0%，極大地增加了腫瘤內(nèi)血流灌注而提高納米藥物的有效遞送，單獨(dú)給予納米藥物治療的腫瘤抑制率僅為42.8%,而rtPA聯(lián)合納米藥物可以提高療效，達(dá)到73.7%的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。

12、　　本部分第二章為環(huán)巴胺調(diào)控高纖維化腫瘤微環(huán)境中 FNs聯(lián)合納米遞藥系統(tǒng)治療腫瘤的研究。本章我們選擇腫瘤基質(zhì)很豐富而新生血管較少的胰腺癌作為腫瘤模型。Hedgehog通路的異常激活是胰腺癌纖維化的重要機(jī)制之一，而胰腺癌組織的纖維化極大地阻礙了藥物的瘤內(nèi)遞送。我們通過免疫熒光染色證實(shí)Hedgehog通路的抑制劑環(huán)巴胺（50 mg/kg/d灌胃，共三周）可以有效抑制胰腺癌的組織纖維化，減少FNs的分布，解除FNs對(duì)腫瘤內(nèi)血管的擠壓，從而增加

13、腫瘤內(nèi)的血流灌注。與空白制劑處理組相比（32.6±4.4%），環(huán)巴胺的處理使功能化血管的比例增加到了72.9±5.8%。通過小動(dòng)物活體成像進(jìn)一步證實(shí)環(huán)巴胺處理后納米粒在腫瘤內(nèi)的分布增加1.8倍，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明環(huán)巴胺處理后，包載化療藥物的納米粒對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為55.2%，與單獨(dú)給予納米藥物（抑制率26.3%）相比，顯著地抑制了皮下荷瘤小鼠模型上腫瘤的生長(zhǎng)。
　　本部分第三章為塞來昔布多靶點(diǎn)調(diào)控腫瘤微環(huán)境結(jié)合納米遞藥系統(tǒng)治療腫瘤的

14、研究。本章我們選擇腫瘤基質(zhì)和新生血管均較為豐富的A549肺癌作為研究模型，通過同時(shí)調(diào)節(jié)包括 FNs在內(nèi)的多種腫瘤微環(huán)境成分，提高納米遞藥系統(tǒng)的腫瘤治療效果。對(duì)荷肺癌皮下瘤模型的小鼠給予口服塞來昔布（200 mg/kg/d）兩周通過免疫熒光染色證實(shí)，塞來昔布可以有效減少腫瘤內(nèi)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和FNs的分布，可以減少對(duì)血管的擠壓，同時(shí)塞來昔布可能還可以促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管的正?；?，從而增加了腫瘤內(nèi)的血流灌注；小動(dòng)物活體成像表明塞來昔布的處理可以