乳腺癌耐藥相關(guān)膜蛋白CK8的發(fā)現(xiàn)及其作為耐藥腫瘤治療靶點的研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)是制約臨床腫瘤治療有效性的主要原因之一。MDR形成機(jī)制復(fù)雜，其中ABC轉(zhuǎn)運泵蛋白介導(dǎo)的藥物外排作用是廣泛存在的主要耐藥機(jī)制。但越來越多的研究表明：藥物作用同時激活腫瘤部位多種基因，多種分子機(jī)制協(xié)同參與耐藥表型的形成，即多因素耐藥。例如，化學(xué)抑制劑或特異性反義核酸和siRNA作用于以ABC轉(zhuǎn)運泵蛋白過表達(dá)為耐藥表型的腫瘤細(xì)胞，盡管完全抑制轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，但不

2、能相應(yīng)恢復(fù)耐藥細(xì)胞對化療藥的敏感性，提示多因素耐藥機(jī)制共存。同時，多種耐藥逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用一直未取得顯著性進(jìn)展，部分原因可歸結(jié)為這些針對單個腫瘤耐藥因素的治療盡管有效抑制其中某個特定機(jī)制，卻不能影響其他共存的耐藥機(jī)制的作用，因而不能完全逆轉(zhuǎn)耐藥。鑒于此，發(fā)現(xiàn)新的MDR相關(guān)蛋白，對進(jìn)一步認(rèn)識和理解腫瘤耐藥發(fā)生的潛在分子機(jī)制，以及為臨床克服腫瘤耐藥提供新的診斷和治療靶點，均具有重要意義。 此外，特異定位于細(xì)胞膜表面的膜蛋白作為疾病診

3、斷和治療的靶點，尤其作為腫瘤表面標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤靶向治療具有一定優(yōu)越性。例如，單克隆抗體是目前一大類有效且應(yīng)用廣泛的腫瘤診斷及靶向治療劑。與胞漿抗原蛋白相比，膜蛋白暴露于細(xì)胞外表面因而更易被單抗所識別、交聯(lián)進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。因此，本文的研究集中于尋找耐藥腫瘤細(xì)胞膜表面的MDR分子及其與MDR的相關(guān)性，進(jìn)而探討以此蛋白為靶點進(jìn)行逆轉(zhuǎn)MDR治療的可行性。 首先，發(fā)現(xiàn)并鑒定耐藥細(xì)胞特定表達(dá)的MDR相關(guān)膜蛋白。目前能夠進(jìn)行高通量篩選的

4、cDNA Microarray和大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)已成功用于差異蛋白的表達(dá)分析，但由于膜蛋白疏水性和表達(dá)豐度低等結(jié)構(gòu)特性的限制，這些方法在膜蛋白分析中的效果有限。因此，本文采用同樣基于質(zhì)譜分析的方法，但與這些直接差異篩選不同的新策略。我們以一株經(jīng)米托蒽醌(Mitoxantrone，MX)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的、乳腺癌耐藥蛋白(Breast Cancer Resistant Protein，BCRP)過表達(dá)的乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/MX作為模

5、型。用完整的MCF-7/MX活細(xì)胞免疫Balb/C小鼠，得到能特異識別耐藥細(xì)胞膜表面抗原的雜交瘤細(xì)胞庫；通過對MCF-7敏感和MCF-7/MX耐藥細(xì)胞的選擇性篩選，獲得與兩者結(jié)合能力不同的單克隆抗體，這些抗體攜帶特定的耐藥蛋白標(biāo)識信息；進(jìn)而通過免疫沉淀分離出在敏感和耐藥細(xì)胞差異表達(dá)的靶蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-MS/MS二級質(zhì)譜鑒定及一系列細(xì)胞生物學(xué)和生化方法驗證，最后明確差異表達(dá)的蛋白為角蛋白8(Cytokeratin 8，CK8)

6、；尤為重要的是，激光共聚焦顯微鏡觀察到CK8特異性的細(xì)胞膜定位；用CK8 siRNA干擾后，耐藥細(xì)胞膜表面CK8的過度表達(dá)顯著抑制，有力說明我們的結(jié)論：CK8表達(dá)于細(xì)胞膜表面，且在耐藥細(xì)胞MCF-7/MX表達(dá)水平增加。因此，抗體差異篩選聯(lián)合質(zhì)譜鑒定用于尋找細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的方法是有效的，為發(fā)現(xiàn)特定細(xì)胞表面標(biāo)志及腫瘤相關(guān)蛋白等提供了新思路。同時，我們也獲得特異性識別膜蛋白CK8的單抗9C6，盡管不具備抗體中和活性，但有很強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合能力，

7、為膜蛋白CK8的功能研究提供手段；并且9C6沒有細(xì)胞毒性，有可能作為載體，與放射性同位素、前藥或生物毒素等形成偶聯(lián)物，靶向殺傷耐藥腫瘤細(xì)胞，用于免疫治療。 到目前為止，盡管很多研究已明確角蛋白CK8能定位于某些腫瘤細(xì)胞膜表面，但膜蛋白CK8的生理或病理性功能卻未知。本文首次發(fā)現(xiàn)CK8在耐藥的腫瘤細(xì)胞膜表面過度表達(dá)，直接將膜CK8和腫瘤耐藥性相聯(lián)系，并進(jìn)一步探討了膜蛋白CK8過表達(dá)與腫瘤耐藥的相關(guān)性。我們用針對CK8三個靶位點的s

8、iRNAs特異抑制MCF-7/MX細(xì)胞膜蛋白CK8的過表達(dá)后，細(xì)胞對化療藥米托蒽醌、拓?fù)涮婵岛腿峒t霉素的敏感性分別增加了40.2％，33.0％和62.2％。(P<0.01)；同時轉(zhuǎn)染CK8表達(dá)載體在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3獲得外源性CK8表達(dá)，導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞對米托葸醌產(chǎn)生耐藥性，耐藥倍數(shù)達(dá)到33倍，這些結(jié)果初步證實膜蛋白CK8過表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。 我們進(jìn)一步對膜蛋白CK8參與腫瘤耐藥的可能機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)耐

9、藥細(xì)胞MCF-7/MX對纖維粘連蛋白(Fibronectin)和玻璃粘連蛋白(Vibronectin)的粘附能力比MCF-7敏感細(xì)胞顯著增強(qiáng)。更為有趣的是，抑制CK8的表達(dá)顯著降低耐藥細(xì)胞對Fibronectin和Vibronectin的粘附性，而對敏感細(xì)胞的粘附性卻沒有影響；為排除胞漿CK8的干擾，以膜蛋白CK8表達(dá)陰性的HEK293細(xì)胞作為對照。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染CK8 siRNAs后粘附性并不發(fā)生改變，特異性說明是膜蛋白CK8導(dǎo)

10、致耐藥細(xì)胞粘附性發(fā)生改變。至此，我們的研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白CK8的另一個新的功能：參與細(xì)胞粘附，且在耐藥細(xì)胞的粘附性增加中起重要作用。而細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)問粘附性的改變在腫瘤耐藥的發(fā)生、維持中起重要作用，這一類耐藥機(jī)制稱為“粘附耐藥”(Adhesion-mediateddrug resistance，CAM-DR)。我們推斷在米托葸醌藥物長期誘導(dǎo)選擇下，CK8在耐藥細(xì)胞膜表面過量表達(dá)，增加細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，繼而使耐藥細(xì)胞通過

11、改變粘附性而形成部分耐藥表型。但是膜蛋白CK8如何直接作用或通過與其他分子如粘附蛋白等相互作用而間接影響耐藥細(xì)胞的粘附性，目前尚不明確，有待進(jìn)一步闡明。 由于CK8表達(dá)水平和細(xì)胞定位的改變，與BCRP表達(dá)增加共存于耐藥腫瘤細(xì)胞MCF-7/MX中，我們又從蛋白表達(dá)水平和功能角度，考察這兩種蛋白之間是否有關(guān)聯(lián)，以及兩者以何種作用方式參與耐藥表型的形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CK8 siRNA并不能改變BCRP的表達(dá)水平，反之亦然；與轉(zhuǎn)運蛋白

12、BCRP通過藥物外排作用導(dǎo)致細(xì)胞耐藥不同，CK8并不能影響MCF-7/MX細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積。說明CK8過表達(dá)在腫瘤細(xì)胞耐藥中起直接作用，獨立于其他MDR相關(guān)分子的改變，包括BCRP的高表達(dá)。繼而分別通過共轉(zhuǎn)染CK8和BCRP表達(dá)載體以及siRNA雙干擾抑制CK8和BCRP表達(dá)的方法，以觀察CK8和BCRP同時獲得表達(dá)或表達(dá)缺失對細(xì)胞耐藥性的影響。結(jié)果表明，CK8和BCRP以協(xié)同作用方式通過多因素耐藥機(jī)制參與耐藥表型的形成。 為明確

13、以CK8和BCRP作為多靶點治療耐藥腫瘤的可行性，我們采用短發(fā)夾狀shRNA干擾載體作為可能的基因治療手段，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將CK8和BCRP的干擾載體同時導(dǎo)入MCF-7/MX細(xì)胞，經(jīng)穩(wěn)定篩選，分析細(xì)胞耐藥性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管單獨抑制CK8或BCRP可以有效逆轉(zhuǎn)耐藥性，但同時干擾兩者的共表達(dá)，能更顯著恢復(fù)耐藥細(xì)胞對化療藥的敏感性。這些體外實驗結(jié)果初步證實：針對CK8或BCRP特異性的干擾載體具有明顯的腫瘤耐藥抑制活性，值得進(jìn)一步的體內(nèi)

14、研究；同時，針對多靶點的雙干擾質(zhì)粒很有可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥更為有效的手段。 綜上所述，本文通過一系列研究從腫瘤耐藥相關(guān)膜蛋白分子的發(fā)現(xiàn)、鑒定、功能驗證以及初步機(jī)制探討等方面，證實CK-8在耐藥細(xì)胞膜表面的過表達(dá)與腫瘤多藥耐藥性相關(guān)。膜蛋白CK8作為新的耐藥相關(guān)的膜表面標(biāo)志，有可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥診斷和治療的新靶標(biāo)。同時明確CK8和BCRP通過多因素耐藥機(jī)制共同參與MCF-7/MX細(xì)胞耐藥表型的形成，并為針對多因素耐藥，采取多靶點