AuroraA作為L(zhǎng)uminalA型乳腺癌新型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)的研究.pdf

1、研究背景：根據(jù)ER、PR、Her-2、Ki67的表達(dá)情況可將乳腺癌分為預(yù)后相對(duì)較好的Luminal A型、Luminal B型和預(yù)后相對(duì)較差的Her-2過(guò)表達(dá)型、三陰性乳腺癌。作為一種高異質(zhì)性腫瘤，不同分子分型的乳腺癌患者的預(yù)后存在巨大差異，即使在Luminal A型乳腺癌中，仍有一部分患者的預(yù)后接近三陰性患者，由此可見(jiàn)目前的乳腺癌分子分型仍不夠完善。因此，在乳腺癌各分子亞型中進(jìn)一步尋找有預(yù)后意義的分子標(biāo)記物具有重要的臨床意義。Aur-

2、A作為細(xì)胞有絲分裂期的關(guān)鍵激酶，與多種腫瘤的發(fā)生有密切的聯(lián)系，但其是否可作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素仍存在爭(zhēng)論。同時(shí)Aur-A對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后中的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模撼醪教接?Aur-A是否可作為不同亞型乳腺癌中進(jìn)一步區(qū)分預(yù)后的更準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物。通過(guò)分子信號(hào)通路的研究，更好的了解 Aur-A的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：（1）利用310例，具備12年完整隨訪資料的人乳腺癌組織

3、芯片，進(jìn)行免疫組化染色，分析 Aur-A在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)進(jìn)一步分層分析了解Aur-A是否能篩選出各型乳腺癌患者中預(yù)后不良的亞群。（2）以代表Luminal A型乳腺癌的MCF-7細(xì)胞系作為體外實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，運(yùn)用 siRNA敲除MCF-7細(xì)胞中的Aur-A或使用Aur-A選擇性抑制劑Amg900抑制Aur-A的活性，通過(guò)克隆形成、CCK-8細(xì)胞增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法研究 Au

4、r-A在 Luminal A型乳腺癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。用 Western blot和RT-PCR方法探索Aur-A發(fā)揮相應(yīng)作用的分子機(jī)制。（3）運(yùn)用MCF-7細(xì)胞分別建立慢病毒敲除的荷瘤模型和 Amg900抑制劑的藥物干預(yù)模型，兩組模型分別設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照和空白對(duì)照。觀察兩種模型瘤體生長(zhǎng)速度；并運(yùn)用免疫組化染色檢測(cè)瘤體Aur-A、Ki67、Cofilin、P-Cofilin、PHH3以及Src的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

5、
　　第一部分：Aur-A在浸潤(rùn)性乳腺癌中高表達(dá)，310例患者中陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到0.65％(250/310)，Aur-A的陽(yáng)性和陰性表達(dá)分布與年齡（P=0.451）、病理分級(jí)（P=0.318）、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.777）、腫瘤部位（P=0.387）、臨床分期（P=0.902）、CK5/6（P=0.099）、AR（P=0.512）等無(wú)顯著相關(guān)性；但與腫瘤大?。≒=0.0.030）、ER（P=0.044）、PR（P=0.027）、

6、Her-2（P=0.000）、Ki-67（P=0.013）、P53（P=0.029）、EGFR（P=0.036）、Cofilin（P=0.000）、分子分型（P=0.000）等指標(biāo)具有顯著相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，Aur-A過(guò)表達(dá)是乳腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，Aur-A在LuminalA型乳腺癌中的表達(dá)與其預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）。單因素Cox回歸分析結(jié)果示，Aur-A、E

7、R、PR、EGFR、AR、FAK、Cofilin、Aur-B、分子分型、腫瘤分期等指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而多因素Cox分析中卻只有Aur-A和Cofilin可作為獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)果表明，Aur-A可作為L(zhǎng)uminal A型乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物。
　　第二部分：基于第一部分實(shí)驗(yàn)，對(duì)Aur-A的生物學(xué)功能及作用機(jī)制展開(kāi)初步研究。Aur-A在代表Luminal A型乳腺癌的MCF-7細(xì)胞株中高表達(dá)，使用siRNA敲除MCF-7

8、細(xì)胞中的Aur-A或使用Aur-A選擇性抑制劑Amg900抑制Aur-A的活化后，觀察到其細(xì)胞增殖能力、遷移、侵襲能力、劃痕愈合能力及克隆形成能力均明顯減弱。siRNA敲除細(xì)胞內(nèi)的Aur-A后Cofilin-F-actin通路的磷酸化程度增高，從而減少Cofilin活性的非磷酸化部分，導(dǎo)致Cofilin-F-actin通路的活性降低；另外Aur-A被敲除后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子TGF-β、Snail、Vimentin表達(dá)下降，E-cadh

9、erin蛋白表達(dá)升高；Src、FAK等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子亦發(fā)生相應(yīng)改變。這些信號(hào)通路中的改變均有可能是Aur-A導(dǎo)致乳腺癌不良預(yù)后的分子機(jī)制。
　　第三部分：裸鼠成瘤及抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aur-A病毒敲除細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)成瘤體積和重量明顯小于對(duì)照組；在MCF-7裸鼠成瘤模型中給予Aur-A的選擇性抑制Amg900可有效的控制腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)免疫組化結(jié)果示Aur-A敲除后裸鼠體內(nèi)成瘤中的Cofilin、PHH3等的表達(dá)無(wú)明顯的

10、差異性，但Aur-A、Src、Ki67的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，P-Cofilin明顯高表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　Aur-A可作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素；對(duì)于LuminalA型乳腺癌，其預(yù)后意義尤為顯著。
　　Aur-A作為上游基因可調(diào)控Cofilin-F-actin、Src、FAK及EMT相關(guān)因子TGF-β、Snail、Vimentin、E-cadherin等蛋白的表達(dá)，通過(guò)其它多條侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的分子共同作用，實(shí)現(xiàn)