基于p-gp靶點(diǎn)天然小分子化合物DHA和SM抗腫瘤多藥耐藥作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目前，人類(lèi)生存環(huán)境改變，在一些不利的外部環(huán)境作用下，腫瘤的發(fā)病率正在逐步上升，成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康、高死亡率的常見(jiàn)疾病?；瘜W(xué)治療是臨床上治療腫瘤的最常見(jiàn)和有效的策略。然而，腫瘤多藥耐藥(MDR)已成為臨床化療失敗的重要原因，故抗耐藥研究和發(fā)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)劑成為抗腫瘤研究的重要方面。來(lái)源于自然界的動(dòng)植物、微生物以及海洋生物的天然藥物是新藥研發(fā)的重要源泉。多酚化合物是存在于自然界的最為普遍的天然化合物，雙聯(lián)芐(Bisbibenzyl)是苔鮮植物

2、中特有的一類(lèi)天然多酚類(lèi)化合物，具有昆蟲(chóng)拒食、抗微生物、抗氧化、抗真菌、細(xì)胞毒、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和抗血小板凝集等顯著而廣泛的生物學(xué)活性。近期研究報(bào)道表明，雙聯(lián)芐化合物可以作用于P-糖蛋白、環(huán)氧合酶等靶點(diǎn)產(chǎn)生生物學(xué)活性。目前，已從苔鮮植物中分離得到了許多具有耐腫瘤多藥耐藥的活性化合物。本論文的研究對(duì)象之一Dihydroptychantol A(DHA)是山東大學(xué)天然藥物研究所從苔蘚植物狹葉花萼苔中得到的新型聯(lián)芐化合物。該化合物已經(jīng)被全合成，同時(shí)

3、也證實(shí)了其抗真菌活性。為了研究該化合物的其他生物活性，我們首先利用多種多藥耐藥細(xì)胞株和其親本的敏感細(xì)胞株，用MTT法篩選了包括雙聯(lián)芐在內(nèi)的多個(gè)多酚化合物的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA的細(xì)胞毒性較低（對(duì)K562/A02、K562細(xì)胞株的IC50均大于40μM），卻能明顯逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞株對(duì)阿霉素的耐藥性。隨后，我們進(jìn)一步展開(kāi)了DHA在體外逆轉(zhuǎn)MDR作用機(jī)制的研究。以多藥耐藥的阿霉素抗性的K562/A02細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，研究了D

4、HA及其衍生物（化合物1-3）的抗腫瘤活性。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，DHA在四種化合物中的抗腫瘤活性是最強(qiáng)的;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的DHA處理K562/A02細(xì)胞后，阿霉素和羅丹明123在K562/A02細(xì)胞中的累積明顯增加。同時(shí)還減少了羅丹明123的泵出量，說(shuō)明DHA抑制了P-gp的外排泵功能。用流式細(xì)胞儀和RT-PCR對(duì)P-gp的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA處理K562/A02細(xì)胞24小時(shí)，P-gp蛋白表達(dá)和MDR1 mRN

5、A的表達(dá)均減少，具有濃度依賴(lài)性。但DHA對(duì)其親本細(xì)胞K562細(xì)胞無(wú)明顯影響。以上試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，DHA能夠有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，該作用與其抑制P-gp的功能、蛋白表達(dá)和降低MDR1 mRNA水平有關(guān)。
　　本論文的另一部分內(nèi)容是研究從中藥茄屬類(lèi)植物龍葵中分離得到的甾體生物堿類(lèi)化合物龍葵堿Solamargine(SM)單體對(duì)多藥耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該化合物具有高效低毒的特點(diǎn)。這一部分實(shí)驗(yàn)觀察了化合物SM對(duì)三種耐

6、藥細(xì)胞K562/A02，KB/VCR和H460/paclitaxel(Taxol)的細(xì)胞毒性和相關(guān)機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，SM能明顯抑制三種耐藥細(xì)胞株的增殖，與對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞株K562，KB和H460相比具有相同甚至更敏感的生長(zhǎng)抑制作用。DAPI核染色和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SM可顯著促進(jìn)耐藥K562/A02細(xì)胞凋亡。RT-PCR結(jié)果顯示SM能夠下調(diào)MDR1的mRNA水平，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SM能夠抑制P-gp的表達(dá)水平。此外，

7、蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SM處理的耐藥細(xì)胞中bcl-2和actin蛋白表達(dá)降低，bax蛋白表達(dá)升高。以上結(jié)果提示SM能夠明顯誘導(dǎo)MDR腫瘤細(xì)胞的凋亡，這與肌動(dòng)蛋白裂解和MDR1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。這種化合物值得作為一種可以繞過(guò)MDR機(jī)制的用于治療MDR腫瘤的潛在藥物進(jìn)行深入的研究。
　　天然藥物在癌癥的化療中扮演著非常重要的角色。本論文的兩種天然產(chǎn)物DHA和SM都具有抗腫瘤多藥耐藥作用，但機(jī)制不同，都是具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗癌先導(dǎo)物，值得更進(jìn)