小分子化合物水飛薊素和酮康唑?qū)δ[瘤靶點作用機制的研究.pdf

1、研究背景： 惡性腫瘤已成為人類死亡的一個重要原因。近幾十年，腫瘤的手術(shù)及放化療取得了長足的進步，腫瘤患者生存時間明顯延長，但對大部分惡性腫瘤的治療尚未能達到令人滿意的效果。當今抗腫瘤藥物的研制方向主要有：(1)針對腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，尋找新的分子作用(酶、受體、基因)靶點等；(2)尋找小分子靶向性藥物，包括從中草藥等天然產(chǎn)物和已有的化合物庫中尋找活性成分。研究環(huán)境生物因素等外因在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細胞分子改變事件，可為惡性腫瘤的

2、藥物治療尋找新的分子靶點。近來BertVogelstein等人對11個乳腺癌和11個結(jié)直腸癌進行了DNA突變分析，發(fā)現(xiàn)其中存在著約15個主要的細胞信號傳導(dǎo)通路的失調(diào)，并啟示我們，如果通過阻斷這些通路中的始動者“Driver”，而不是僅僅是阻斷個別的從動者“Passenger”基因，則無論這些通路中的基因如何突變，都能起到真正抑制腫瘤生長的作用。由此我們可以認為，研制抑制主要通路中關(guān)鍵基因“Driver”的分子靶向藥物或多靶點的藥物，是靶

3、向治療今后的發(fā)展方向。Vogelstein等人的研究表明，PI3K/Akt信號通路是關(guān)鍵性的幾個信號通路之一。在很多人類腫瘤中普遍存在Akt的高表達，包括肝癌、白血病等，提示Akt可能是一個腫瘤預(yù)防和治療的重要靶點。 我國作為傳統(tǒng)中藥大國，一直以來在中成藥和天然藥物的開發(fā)和研究上具有很多的積累。中藥和天然藥物的疾病預(yù)防和治療以及保健作用比較明確，研制新藥的成功率比較高，潛力大，前景廣。由于中藥的獨特優(yōu)勢，從中篩選高效、低毒的單體

4、化合物用于腫瘤治療和預(yù)防已成為當前腫瘤治療研究的熱點。在天然植物單體化合物庫中進行篩選，篩選得到的化合物一般對人體細胞安全、低毒。 激素和生長因子與其受體組成的信號通路也是腫瘤生長的一個重要因素。雄激素和雄激素受體(AR)對于男性生殖系統(tǒng)及其它組織器官的發(fā)育、分化，以及男性腫瘤如前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，異常的AR活性被認為是前列腺癌進展的關(guān)鍵因素。由于雄激素受體在雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)中常擴增和過表達，抑制AR

5、的表達可能是治療前列腺癌的一個有效方案。酮康唑(KT)常用作抗真菌藥物，已有多個臨床試驗將其用于治療雄激素非依賴性前列腺癌，并能顯著抑制PSA水平和改善病人生活質(zhì)量。但其在體外對前列腺癌細胞的直接作用機理不明。 研究目的： 揭示正常上皮細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化中的信號通路改變，并研究小分子化合物水飛薊素和酮康唑?qū)δ[瘤細胞不同信號通路Akt和雄激素受體AR的作用機制，從而為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。 研究結(jié)果： 本論文主

6、要研究結(jié)果如下： 1微囊藻毒素誘導(dǎo)大腸Crypt細胞轉(zhuǎn)化的分子機制1.1轉(zhuǎn)化細胞MTC中Akt，MAPK信號通路激活微囊藻毒素為我國特有的環(huán)境生物因素，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)微囊藻毒素作用的永生化正常大腸Crypt細胞出現(xiàn)細胞克隆，發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化。 用基因芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)化細胞進行分析，我們發(fā)現(xiàn)Akt通路的多個基因發(fā)生上調(diào)，包括MAPKAPK2，Akt，HER2，cyclinD1和cyclinD3上調(diào)大于兩倍，PI3K上調(diào)大于1.5倍。W

7、esternblot結(jié)果顯示，微囊藻毒素轉(zhuǎn)化MTC細胞中Akt，cyclinD1，cyclinD3和HER2蛋白表達量比正常對照大腸Crypt(NCC)細胞明顯增高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MTC細胞中PI3K，Akt和MAPKAPK2酶活性較NCC細胞明顯提高。 除了Akt信號通路異常激活外，基因芯片結(jié)果顯示，MTC細胞中MAPK信號通路也存在上調(diào)，多個MAPK通路相關(guān)基因上調(diào)大于兩倍，包括R-Ras，B-Raf，JNK1，JNK2和

8、p38等，而Erk1/2MAPK都沒有明顯改變。Westernblot結(jié)果顯示MTC細胞中p38和JNK蛋白顯著上調(diào)，p38和JNK激酶總活性也明顯升高。1.2Akt，p38和JNK信號通路的持續(xù)性激活可能是細胞轉(zhuǎn)化的原因以及有效的腫瘤治療靶點Akt，p38和JNK信號通路在MTC細胞中持續(xù)激活，具體表現(xiàn)為21代和30代MTC細胞中的酶活性與15代細胞沒有明顯差異，且均顯著高于NCC細胞。用Akt酶的抑制劑17-AAG50nM和p38酶

9、抑制劑SB20358010nM顯著抑制了MTC細胞的增殖活性，抑制率分別達42％和33％(與DMSO對照組相比P<0.01)，同樣的，10nM的JNK酶抑制劑SP600125也顯示出了很強的細胞生長抑制作用(P<0.05)，而聯(lián)用17-AAG和SB203580能更強烈的抑制細胞增殖。這些結(jié)果提示Akt，p38和JNK的酶活性可能是微囊藻毒素引起細胞轉(zhuǎn)化所需，這些信號通路可能是微囊藻毒素誘導(dǎo)腸上皮癌變的治療靶點。 2水飛薊素是有效

10、的Akt酶抑制劑2.1多種中藥單體對腫瘤細胞的Akt活性影響選用9種中藥化合物，體外篩選Akt酶抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水飛薊素，辣椒素，和厚樸酚以及兒茶素能明顯下調(diào)腫瘤細胞Akt酶活性。進一步用Westernblot研究發(fā)現(xiàn)，用10，50，100ug/ml水飛薊素處理K562細胞，Akt磷酸化被顯著抑制，而且呈濃度依賴性，而Akt總蛋白沒有明顯改變，提示水飛薊素可能是通過影響Akt蛋白翻譯后修飾而影響其磷酸化。 2.2水飛薊素對K5

11、62細胞的生長抑制作用K562細胞經(jīng)過不同濃度水飛薊素作用48小時后，較低濃度水飛薊素(1ug/ml)對K562細胞的生長沒有影響，隨著濃度升高，K562細胞生長受到不同程度抑制，當濃度大于50ug/ml后，細胞生長受到強烈抑制，抑制率分別為26.5％(50ug/ml)和71.2％(100ug/ml)，呈現(xiàn)濃度依賴性。 2.3水飛薊素誘導(dǎo)細胞凋亡經(jīng)100ug/ml水飛薊素處理48h，Hoechst染色后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)K

12、562細胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮和“凋亡小體”；進一步采用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，用不同濃度水飛薊素(10，50，100ug/ml)處理48hr之后，AV染色陽性細胞顯著增多，證明水飛薊素有效誘導(dǎo)K562細胞發(fā)生凋亡。接著我們用WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)Caspase-3，Caspase-9和PARP的活化產(chǎn)物在水飛薊素處理后條帶明顯增強，且呈濃度依賴性。提示水飛薊素通過介導(dǎo)Caspase-9激活的線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。 3酮康唑(KT

13、)對雄激素受體AR信號通路的下調(diào)作用3.1KT對前列腺癌細胞生長抑制作用前列腺癌細胞LNCaP，LNCaP-C81，LNCaP-Rec4，LNCaP-SF，Du145，PC3和22RV1經(jīng)過不同濃度KT作用48小時后，生長受到不同程度抑制，均呈濃度依賴性。 3.2KT下調(diào)了前列腺癌細胞的AR蛋白表達以及PSA表達，分泌和轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)0，5，10，25ug/ml的KT作用24h和48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KT能不同程度抑制細胞PSA表達，且

14、呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。對培養(yǎng)基上清進行PSA測定，我們發(fā)現(xiàn)細胞PSA的分泌隨著KT濃度的增加而逐漸減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。用RealtimePCR測定KLK3(PSA的編碼基因)的表達水平發(fā)現(xiàn)，KT能顯著抑制前列腺癌細胞的KLK3基因表達，并且具有濃度梯度效應(yīng)，與PSA蛋白表達變化基本一致。PSA是AR的靶基因，由于其mRNA水平受到KT的影響而下調(diào)，我們進一步觀察AR是否被KT影響。Westernblot結(jié)果顯示，經(jīng)KT處理后三種細胞的

15、AR表達水平不同程度的下降，而隨著KT濃度增高，AR表達不斷減少，說明KT下調(diào)了AR信號通路。 3.3KT對細胞周期的影響用流式細胞術(shù)進行檢測發(fā)現(xiàn)，用KT10ug/ml處理22RV1細胞48hr之后，G0/G1期細胞增多，相應(yīng)的S期和G2/M期細胞都減少，提示在KT的作用下22RV1細胞發(fā)生了G0/G1細胞周期阻滯。用Westernblot進一步探討細胞周期蛋白的變化，細胞周期蛋白依賴激酶Cdk4，CyclinD1和D3蛋白受到

16、KT的抑制而表達減少，Cip1/p21和Kip1/p27蛋白水平在KT處理后上調(diào)，呈濃度梯度依賴。 3.4KT誘導(dǎo)細胞凋亡DNALadder實驗顯示，25ug/mlKT處理后22RV1細胞可見明顯DNALadder梯度，提示KT誘導(dǎo)22RV1細胞發(fā)生凋亡。WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)在KT處理后Caspase-9，Caspase-3的切割活化片段條帶明顯增強，PARP也受到活化。 研究結(jié)論： 1.微囊藻毒素導(dǎo)致