水飛薊素及其組分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、本研究為進(jìn)一步開發(fā)水飛薊素的抗腫瘤活性作用并探討其機(jī)理，采用人慢性粒細(xì)胞性白細(xì)病細(xì)胞系K562研究水飛薊素及其所含有的各種主要活性成分對(duì)該細(xì)胞系增殖及凋亡的影響，其中著重研究了采用HPLC分離到的水飛薊賓的兩種非映異構(gòu)體水飛薊賓A和水飛薊賓B對(duì)該細(xì)胞系增殖及凋亡的影響。并在一定程度上闡述上述兩種非對(duì)映異構(gòu)體誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用通路。 采用MTT法、臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法研究水飛薊素及其各種組分對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，比較組分間

2、的活性差異，篩選出活性較強(qiáng)的單體作進(jìn)一步的凋亡研究。在研究藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的作用中，采用Hoechst染色觀察凋亡過程中染色體的變化及定量評(píng)價(jià)凋亡；采用瓊脂糖凝電泳方法檢測(cè)DNA片段化，進(jìn)一步驗(yàn)證凋亡；采用western-blotting免疫印跡技術(shù)及RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)調(diào)控因子的變化；采用單細(xì)胞凝電泳檢查DNA的損傷；并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)ROS和Ca2+的變化，探討其機(jī)理，闡述凋亡通路。 結(jié)果顯示：水飛薊素及其所

3、含的各種組分均具有抑制K562細(xì)胞增殖的作用，并發(fā)現(xiàn)水飛薊賓的兩種非對(duì)映異構(gòu)體均比其未分離前的混合物一水飛薊賓具有更強(qiáng)的抑增殖作用。形態(tài)學(xué)觀察及DNA的檢測(cè)表明，水飛薊賓A和水飛薊賓B可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞發(fā)生染色體凝聚、形成DNAladder及凋亡小體等一系列凋亡的典型特征，并且水飛薊賓A和水飛薊賓B比水飛薊賓本身具有更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用。 機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓的兩種異構(gòu)體在誘導(dǎo)K562凋亡的過程中，可通過線粒體通路

4、激活Caspase-9和Caspase-3，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL上調(diào)促凋亡蛋白Bax；細(xì)胞中P53蛋白也受到了影響，呈現(xiàn)出劑量依賴性升高的趨勢(shì)；單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)出隨著藥物作用時(shí)間的加長(zhǎng)，細(xì)胞DNA的損傷程度加大；RT-PCR檢測(cè)到水飛薊賓A和水飛薊賓B可以抑制細(xì)胞MEK1/2和ERK的表達(dá)，并呈劑量依賴性；且二者均顯著增加了JNK1/2的表達(dá)；在凋亡過程中，水飛薊賓A能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，升高細(xì)胞內(nèi)Ca

5、2+的濃度，但水飛薊賓B的作用則并不顯著，顯示出二者作用機(jī)理的不同；此外，在K562細(xì)胞中表達(dá)量較高的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的c-Abl及Bcr-Abl融合蛋白的表達(dá)水平也被藥物降低。 以上研究結(jié)果表明：水飛薊素及其組分具有抑制人白血病K562細(xì)胞增殖的作用，水飛薊賓A及水飛薊賓B具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用，且二者無明顯差別但較水飛薊賓略高，在作用機(jī)制上也略有不同。水飛薊賓A及水飛薊賓B可通過線粒體途徑，MEK/ERK途徑和JN