腫瘤治療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究概要

1、生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,實驗十三 流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫瘤治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,指導(dǎo)教師：唐穎,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,1. 實驗?zāi)康?了解細(xì)胞凋亡、及流式細(xì)胞技術(shù)原理等基本知識。學(xué)習(xí)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法。學(xué)習(xí)流式細(xì)胞技術(shù)標(biāo)本的制作方法，了解流式細(xì)胞儀的使用。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,2.實驗原理,2.1 細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識2.2 流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及

2、應(yīng)用 2.3 用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的原理,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,2.1 細(xì)胞凋亡的基本知識：,定義：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定程序控制下的自主死亡過程。細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣是機(jī)體生存和發(fā)育離不開的最基本的生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡異常會引起免疫性疾病或腫瘤等。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,（一）、細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時立即出現(xiàn)

3、的反應(yīng)。早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出, 引起炎癥。,細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別,（二）細(xì)胞凋亡cell apoptosis Kerr（ 1972）最先提出，與細(xì)胞壞死的區(qū)別是：①細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；③不引起炎癥；④線粒體無變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電

4、泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,胸腺細(xì)胞,正常,凋亡,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,凋 亡 鑒 定 方 法,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,2.2 流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)是以流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)為工

5、具，在液流系統(tǒng)中對懸液中的單個細(xì)胞、細(xì)胞器或生物粒子的生物、物理和化學(xué)特性進(jìn)行快速測量并自動分析，并根據(jù)這些特性將所需要的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的高技術(shù)。 它的主要特點是，可以在單細(xì)胞水平上對大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)的定量分析及分選，借此判斷細(xì)胞的體積、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)，并可在無菌狀態(tài)下，對活細(xì)胞進(jìn)行分類收集，收集的純度可達(dá)99％。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研

6、究室,流式細(xì)胞儀工作原理,,流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,散射光信號,,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,散射光信號,Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detecto

7、r ? Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,外周全血細(xì)胞散

8、射光雙參數(shù)點圖（紅細(xì)胞溶解后）,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,流式細(xì)胞儀的檢測信號,熒光信號使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,熒光信號,雙色直接染色,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)存儲: LIST MODE,數(shù)據(jù)顯示: 直方圖 ( Histogram )二維點圖(Dot Plot)等高線圖(Co

9、ntour Plot)密度圖 (Density)三維圖（3D Plot）等,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,數(shù)據(jù)分析,點圖分析,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,數(shù)據(jù)分析,等高圖和密度圖分析,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,2.3 用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的原理,利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射可對凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析。凋亡早期細(xì)胞因體積減小，胞

10、漿及染色質(zhì)固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大，凋亡晚期細(xì)胞FSC、SSC均變小，壞死細(xì)胞則因細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內(nèi)含物釋出后FSC、SSC均變小。用流式細(xì)胞儀也可以根據(jù)DNA含量不同，從細(xì)胞群體中鑒別凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰（Ap峰）。通過此峰下的面積值可得出凋亡細(xì)胞在所測細(xì)胞群中所占的比率（用凋亡軟件定量）。另外，細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，有賴于某些蛋白質(zhì)的合成，用流式細(xì)胞儀

11、可同時測定凋亡細(xì)胞的FSC/SSC及DNA/蛋白質(zhì)，進(jìn)行多參數(shù)分析以研究不同的凋亡誘導(dǎo)作用機(jī)制。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,3.實驗材料、用品,實驗材料：培養(yǎng)的Hela細(xì)胞實驗用品： ①儀器與用具 C02培養(yǎng)箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡和離心機(jī)等。 微量加樣器(1µl-1ml)，0.5 ml和1.5 ml的Eppendorf管，20µl、200µl和1ml吸頭，10ml

12、培養(yǎng)瓶，載玻片，蓋玻片等。 ②試劑 放射線菌素D（誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤治療藥物，如喜樹堿、紫杉醇、中藥砒霜等）；熒光探針：用PBS(pH7.4)將PI配成500 µg/ml的貯液，在-20℃凍存。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,FACSCalibur, BD Bioscience,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,4.實驗步驟,Hela細(xì)胞的傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：向?qū)?shù)生長期細(xì)胞中加入放射線

13、菌素D（可結(jié)合科研采用其他誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤治療藥物）分別為0.25、0.5、1、2、4mg/L, 作用6小時。用胰酶消化以上五個樣本以及對照的細(xì)胞，吹打收集于離心管中，1000r/min下離心8分鐘，倒去上清。加約1ml PBS重懸細(xì)胞，用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中，固定8小時以上。去上清，用PBS 4ml重懸細(xì)胞，再1000r/min下離心8分鐘，去上清控干液體后加0.3mlPBS ，加入RNA酶A至終濃度為5

14、0ug/ml，37℃孵育30分鐘。將樣品插到冰浴中，停止酶的作用。待冷卻后加入50ug/ml 的PI 1.5ml,放于冰上在冰箱中染色至少30分鐘。3個小時之內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測樣品。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,5.實驗結(jié)果,正常,凋亡,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,26,化療前后胃癌活檢標(biāo)本中Caspase-3+細(xì)胞,化療前(3.49%),化療后(94.86%),,,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研

15、究室,細(xì)胞凋亡——PI分析,PI - Fluorescence,# Events,凋亡細(xì)胞,,正常G0/G1期細(xì)胞,,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,6. 注意事項,細(xì)胞數(shù)目要充分；為防止細(xì)胞成團(tuán)，可在用流式檢測前用篩網(wǎng)過濾?？山Y(jié)合科研，將課題組項目中研究的一些凋亡誘導(dǎo)劑作為研究對象進(jìn)行分析。并在此綜合實驗中掌握動物細(xì)胞的傳代技術(shù)，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)分析及流式細(xì)胞技術(shù)。,生物科學(xué)與工程系細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)研究室,7.思考題,制